Class Notes (837,186)
Canada (510,155)

15 March 18, 24-Neurotrophins as therapeutics.docx

12 Pages
Unlock Document

Life Sciences
Margaret Fahnestock

LECTURE 15 LIFESCI 3B03 Neurotrophins as Therapeutics March 18, 24 2014 Mechanisms for Treating CNS Disease − Gene transfer to the brain − RNA transfer to the brain − Protein transfer to the brain − Limitations and technological hurdles − Choice of appropriate targets/strategies  − The BBB makes the brain a difficult target − Brain made out of blood vessels o Inject plastic into blood vessels; plastic hardens, brain tissues around it dissolves  o Able to see that blood vessels form a barrier between body and brain tissue  o Very tight barriers against anything in the blood o Difficult to get therapeutic into the brain  Inject something into the blood stream, few ways to get it across the BBB  o Protection mechanism from toxins getting to the brain; immunological and pharmacological  o Lined with epithelial cells with transporters in membrane; brings nutrients that brains need into the brain tissue   Therapeutics either have to be injected or somehow get through BBB (there are some techniques) Requirements for Gene Transfer to the Brian − Large transgene capacity o Vector the carry gene (usually viruses) – need large capacity; most mammalian genes have large introns; if transfer whole gene, gene will  be large  o Need to transfer gene and promoter as well  o Goal – viral vectors with large transgene capacity  − High transduction efficiency o Put virus into brain, need it to affect a large number of cells (virtually every cell it comes into contact with) − Stability of transgene expression o Need gene to be present for a long time; brain cells are post­mitotic, last a long time – must keep the gene available and making its product  for a long time − Appropriate levels of transgene expression o Fine balance; just as bad to have too much as too little  o Promoter elements necessary to be with gene – often many kilo­bases away − Cell specificity of gene transfer  o Brain is made up of a number of cell types; want transgene to affect mostly neurons o Eg/ If all virus is taken up by glial cells and not neurons – not helpful − Lack of toxicity and immune response  o Non­toxic; do not want to elicit immune response; immune response might be as damaging as disorder trying to cure  Delivery of Genes to the CNS1 − Viral vectors – DNA (to overexpress) and RNAi (inhibit expression) o Retrovirus o Herpes simplex o Adenovirus o Adeno­associated o Lentivirus  − Liposomes  o Not highly used but can be used in certain circumstances  − Cell­mediated transfer  o Includes stem cells Retrovirus 1 LECTURE 15 LIFESCI 3B03 − Limited to mitotic cells o Most neurons are post­mitotic; only few neurons generated in sub­ventricular zones are part of neurogenesis process − Cannot infect neurons − Low titers, low levels of viral integration and transient gene expression o Low titers – hard to put enough particles into the brain to have effect o Transient – doesn’t last very long − Used for delivery of genes into cells that are grafted into brain  o Solves the problem of not being able to infect neurons – deliver cells into brain that will secrete neurons that affect the neuron o Can effect enough cells to make it worthwhile – infect cells outside of brain, implant them and they secrete enough protein o Still transient and not long lasting − Used mainly for infecting fibroblasts and in animal studies  Herpes Simplex Virus − Infects neurons and other post­mitotic cells − No integration in host genome, but virus can either enter latency or lytic infection (lyses the cell) − Neurotoxic o Particularly toxic in wild­type  − Wild­type can revert to lytic infection − Transient gene expression  − Good potential, but not widely used Adenovirus − Will infect neurons and other post mitotic cells − Low neurotoxicity − High capacity (35 kb) o Relative to other viruses o Still does not have the capacity for a 400 kb gene for example − Gene expression without integration, but transient gene expression − Inflammatory response  o Part of the reason why its transient o Inflammatory response causes virus to be cleared from brain  AAV (Adeno­Associated Virus) − Less inflammatory response than adenovirus, longer gene expression − But smaller capacity than adenovirus − Gene expression without integration, forms episomes Lentivirus − Gaining popularity − Infects post mitotic cells − Large capacity − Longer gene expression  − Less inflammatory response Liposomes − Do not have to use virus because there are a lot of resistance against using them in the brain; neurodegenerative diseases, there is not a lot of choice − Bags of lipids in which therapeutic molecules (RNA, genes, proteins) can be packaged into  − Low toxicity − Easy to prepare large quantities − No cell type specificity o Whatever membrane they come to, they will fuse with 2 LECTURE 15 LIFESCI 3B03 − Low transfection efficiencies o Fusion rate with cell membrane is low − Very transient expression  o Not integrated into genome − Good for animal experiments Delivery of Genes to the CNS II − Encapsulated cells o Reduced toxicity and immune rejection − Cell­mediated transfer o Genetically engineered fibroblasts  Grow in a dish, can engineer them (eg/ infect with virus that expresses desired protein); can implant into various parts of brain  (eg/ hippocampus to treat AD; striatum for PD) – fibroblasts with secrete protein for as long as the gene is stable and the cells  last   Cells don’t last very long because brain launches immunological response to clear fibroblast   Encapsulating the cells (lipid or algae like) – capsules form a barrier between implanted cells and brain tissue; pores big enough  for protein to get out, but small enough to block immune responses   Have been used in clinical trials  o Neural progenitor cells (stem cells) – differentiation and integration are challenges   Undifferentiated cells usually do not make desired protein; have to be differentiated (in vitro or in vivo); cell doesn’t stay in  differentiated state you want it to   Can stem cells integrate into brain networks and replace brain cells?  Inject stem cells into the brain when cell shave been lost – want stem cells to differentiate into neurons (not glia) then insert  themselves into neural networks and replace lost cells  Able to migrate through the brain Transplantation of Cells into the brain − Genetically engineered fibroblasts o Easy to clone, ideal for genetic manipulation  o Easy to prepare large amounts for transplantation o Transient expression, poor survival − Stem cells and neural progenitor cells o Easy to clone, ideal for genetic manipulation o Easy to prepare large amounts for transplantation o Ability to migrate through the CNS Deliver of Proteins to the CNS − CNS Injection/Infusion – requires drilling through the skull for longer term infusion; tube (indwelling catheter) must be put in place to infuse  continuously; not ideal o Risk of infection  o Very transient effects (injections) o Flooding the brain with neurotrophins – must more protein than would normally be used in order to get therapeutic amount to desired area;  this can have biological results − BB Permeabilization (osmotic) o Neurotoxicity − Carrier Proteins o Costly, not targeted, inefficient o Eg/ Can fuse a protein to antibody of the transferrin receptor; will fuse to epithelial cells on BBB and will be transported across o Fuse therapeutic protein to protein that usually crosses the BBB o Not targeted because the transporter is pressed in the endothelial cells; therapeutic molecule goes all over the brain, not to desired location   ▯inefficient  − Regulated delivery is desirable – to deliver gene product or protein at the right levels to the correct location, when the cells need it (right amount,  right place, right time); using vectors (eg/ stem cells and viruses) that can regulate release od proteins o Don’t know enough about regulatory regions about therapeutic proteins to allow for proper regulation  3 LECTURE 15 LIFESCI 3B03 − Patients are willing to undergo less desirable tests when there are no other options  Where is the Best Delivery Location? − Axons along the nigrostriatal pathway are partially preserved – these rescued axons provide the substrate for sprouting and regrowth into the area of  high GDNF expression (indicated by green color in C), which in turn is accompanied by a gradual functional recovery − Injection of the vector into the substantia nigra (D), by contract, protects the nigral cell bodies but is unable to preserve the axonal projection to the  striatum – instead, there is extensive sprouting of TH­positive fibers in regions close to the rescued cell bodies, i.e. into the area of high GDNF  expression (green color in D) − Have to be careful about where therapeutic cells or viruses are delivered − Striatum and Nigra o Send process to striatum – lack of dopamine in PD  − Lesion striatum – kill most, but not all, neurons in Nigra­striatal pathway  o Mimics PD – little neurons in substantia Nigra − AAV­virus – expresses GDNF o Inject into substantia Nigra, supports cell bodies, but does not increase axonal projection to the striatum o If GDNF is in striatum (target tissue), cell bodies grow to connect  − Delivery location for therapeutic region is chosen carefully  − Cell bodies of DA neurons that extend processes to the striatum – neurons die in PD − B) Inject striatum with MPTP or poisonous molecule – kills most neurons, leaving a few intact − D) Can rescue neurons from cell body level; inject virus that expresses GDNF into substantia Nigra o Do not recue behaviour – GDNF in substantia Nigra – cells have no incentive to send axons to striatum to form connections − C) AAV­GDNF in striatum – few neurons can transport retrograded; cell bodies that have not yet died can resprout and send axons to striatum from  substantia nigra and restore connections  − Which receptors are expressed o Eg/ RET­ likely uses GDNF as a survival factor Relevance of Neurotrophic Factors to Neurological Disorders  − Diseases characterized by death in certain areas of brain − Survival supported by different NFs Neurotrophic Factor Neuronal Target Disorder NGF  Basal Forebrain AD Striatal Cholinergic HD BDNF Basal Forebrain AD Striatal HD Dopaminergic PD Motoneurons ALS CNTF Motoneurons ALS Striatal HD GDNF Dopaminergic PD Motoneurons ALS − AD – give patient NFG or BDNF; not CNTF or GDNF because neurons do not have 
More Less

Related notes for LIFESCI 3B03

Log In


Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.