Class Notes (836,128)
Canada (509,645)
Biochemistry (235)
BCH3120 (19)
Zemin Yao (1)
Lecture

Supplementary Notes - Lipid & AA Metabolism.pdf

53 Pages
138 Views
Unlock Document

Department
Biochemistry
Course
BCH3120
Professor
Zemin Yao
Semester
Winter

Description
BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013    Lipid and Amino Acid Metabolism    COURSE NOTES  (Supplementary materials for   slide presentations)    BCH3120 / 2013      Zemin Yao  Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology  University of Ottawa  E‐mail: [email protected]         1    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Table of Contents    Introduction.................................................................................................................................... 3  1. Fatty acid β oxidation and Ketogenesis ....................................................................................... 3  2. Fatty acid and triacylglycerol synthesis........................................................................................ 9  3. Phospholipid synthesis .............................................................................................................. 14  4. Biosynthesis of cholesterol........................................................................................................ 20  5. Lipoprotein metabolism ............................................................................................................ 26  6. Regulation of cholesterol homeostasis ...................................................................................... 33  7. Amino acid deamination and the urea cycle .............................................................................. 40  8. Biosynthesis of amino acids and related molecules.................................................................... 46  9. Regulation of  amino acid metabolism........................................................................................ 50      2    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Lipid Metabolism ‐ Introduction  The objective of the next six lectures titled “Lipid Metabolism” is intended to give students an overview on  the anabolism (i.e. synthesis) and catabolism (i.e. degradation) of the most abundant lipids in mammalian  cells. Specifically, students are expected to become familiarized with metabolic pathways for major lipid  classes and the subcellular  locations that each pathway takes place (i.e. compartmentalization). In addition,  students are expected to understand the biological significances of lipid metabolic pathways, and to  appreciate the intricacies of regulatory mechanisms by which the homeostasis of each lipid class is  achieved.  Lipid Metabolism ‐ Course Outline  We start with the fatty acid β oxidation, which represents one of the major metabolic pathways in  mammals for fuel generation and energy utilization. The β oxidation occurs in the mitochondria, and the  biochemical reactions involved in the process were elucidated by early work. More recently, the  involvement of peroxisomes in β oxidation has been recognized. Clinically,  drugs that can enhance  peroxisomal action have been developed to promote β oxidation of fatty acids as an effective means to  fight against excessive accumulation of fat (i.e. obesity) and related metabolic abnormalities. Thus, in the  lecture of “Fatty Acid β Oxidation,” both mitochondrial and peroxisomal pathways will be discussed.  In  addition, β oxidation of unsaturated fatty acids, common in diet, will also be briefly described.  1. Fatty acid β oxidation   Structure and nomenclature of fatty acids  It is common to hear the terminology of “saturated” and “unsaturated” fatty acids, which denotes the  absence or presence of double bonds within a fatty acid molecule. The naturally occurring double bonds in  unsaturated fatty acids often assume cis configuration and rarely trans configuration. Trans fatty acids are  by‐products of hydration of unsaturated fatty acids in dairy industry.  Conventionally, the position of double bond is indicated by Δ followed with numerals that are counted  beginning at the COOH functional group. Thus, 18:1Δ9 defines a fatty acid molecule of an 18 carbon chain  with a double bond at position 9 (counted from the COOH function group denoted as 1).  Alternatively, the position of double bound is indicated by numerals with respect to the end that is opposite  of the COOH functional group. In this case, the end of the fatty acid molecule is denoted ω (the last  alphabet in Greek). Thus, 18:1ω‐9 describes a fatty acid molecule of an 18 carbon chain with a double bond  at position 9 with respect to the ω end. This nomenclature for fatty acids is usually used to describe  polyunsaturated fatty acids in which the double bond starts at positions 3 or 6 with respect to the ω end.  Hence we hear the terminology of ω‐3 and ω‐6 fatty acids. For example, EPA (eicosapentaenoic acid) is  commonly denoted 20:5(ω‐3) to specify the molecule of 20 carbon chain with 5 double bonds starting at  position 3 from the ω end.    3    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Fatty acid β oxidation in mitochondria  Now let’s look at the biochemical pathway responsible for β oxidation in mitochondria. Because the  mitochondrial inner membranes are not permeable to long chain fatty acids (> C ), there are two  7 prerequisite steps precede β oxidation in mitochondria. They are (i) activation of fatty acyl chain (C 8C 20  and (ii) transport of the activated fatty acyl chain into the mitochondria.  Activation of fatty acids  Activation describes a biochemical reaction catalyzed by ACS (acyl‐CoA synthetase), which requires  hydrolysis of ATP to drive the formation of acyl‐CoA.   ACS  In mammalian cells, there are at least five different ACS exists that are responsible for acyl‐CoA formation  related to mitochondrial β oxidation. For short chain fatty acids (C 20). Thus, ACS responsible for >C  f20ty  acyl‐CoA synthesis occurs in the lumen of peroxisomes. ACS responsible for long chain fatty acids (C 16‐C20 is  present on the surface of peroxisomes.  Transport of acyl‐CoA into mitochondrial matrix  The inner membrane of mitochondria is impermeable to acyl‐CoA with chain length >C . To transpor7 the  acyl‐CoA from cytosol to mitochondrial matrix, the acyl‐CoA molecule must be converted to acyl‐carnitine.  Carnitine palmitoyltransferase (CPT1) catalyzes this reaction on the outer membrane of mitochondria. The  resulting acyl‐carnitine can be transported across the inner membrane into the mitochondrial matrix  through a transporter protein (also called translocase).  There is another CPT (CPT2) located within the mitochondrial matrix that converts acyl‐carnitine back to  acyl‐CoA.   CPT  There are multiple forms of CPT present in different cell types (e.g. liver, heart and kidney). Because  formation of acyl‐carnitine represents the committing step for β oxidation, the activity of CPT is highly  regulated under different metabolic conditions (see below). Deficiency in CPT activity in humans is  associated with severe metabolic abnormalities.    4    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  β Oxidation within the mitochondrial matrix  Once acyl‐CoA is present in the mitochondrial matrix, it subjects to β oxidation process that is composed of  four biochemical reactions. The four reactions are (i) first dehydrogenation between α−β bond (Note: the  carbon immediately adjacent to the thioester linkage is the α carbon), (ii) hydration of the α=β double  bond, (iii) second dehydrogenation resulting in β‐ketone (thus the name of β oxidation), and (iv) cleavage  between α−β bond. The last reaction results in a new acyl‐CoA molecule that is 2 carbon atoms shorter  than the original one. The new acyl‐CoA is subjected to a next round of β oxidation process. Each round of β  oxidation yields one (1) acetyl‐CoA, one (1) FADH 2, and one (1) NADH, all of which can be utilized for ATP  generation through oxidative phosphorylation.   Acyl‐CoA dehydrogenase (FAD‐dependent)  Acyl‐CoA dehydrogenase, or AD, catalyzes the first β oxidation reaction. In mammalian cells, there are  different AD present responsible for different chain length acyl‐CoA molecules. Thus, there are VLCAD (for  very long chain acyl‐CoA), LCAD (for long chain), MCAD (for medium chain), and SCAD (for short chain),  respectively. The MCAD is a tetramer that is composed of four identical subunits; each subunit contains a  FAD molecule. Deficiency of MCAD in humans has profound pathologic impact on  infant development.  Enoyl‐CoA hydratase (EH)  Enoyl‐CoA hydratase catalyzes the hydration reaction of trans enoyl‐CoA. This enzyme is stereospecific; it  only acts on trans α=β configuration and not cis α=β double bond.  + Hydroxyacyl‐CoA dehydrogenase (NAD ‐dependent) (HAD)  There is nothing special about this reaction. However, what is interesting is that the enzyme activities of EH  and HAD for long chain acyl‐CoA molecules are encoded in one protein molecule (i.e. a multi‐domain, multi‐ function enzyme).   β‐ketoacyl‐CoA thiolase (KT)  The thiolase catalyzed reaction is reversible. Thus the same enzyme can also catalyze condensation  reactions for fatty acid synthesis (see Fatty Acid Elongation below).   EH‐HAD‐KT octamer  Four EH/HAD enzyme subunits and four KT enzyme subunits form an octamer for long‐chain acyl chain β  oxidation process. For short and medium chain acyl‐CoA β oxidation process, the EH, HAD and KT activities  are encoded by separate enzyme molecules.  β Oxidation of unsaturated fatty acids    5    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Human diet contains various unsaturated fatty acids (e.g. oleic acid and linoleic acid). Degradation of  unsaturated fatty acids in mammalian cells is also achieved through the same β oxidation process.  However, there are a few additional enzymatic reactions needed to overcome spatial hindrance imposed by  the position of the double bonds.   Problem 1 – spatial hindrance of the cis β=γ double bond   The position of Δ9 cis double bond in oleic acid or linoleic acid prevents the hydration reaction catalyzed by  EH, because EH only recognizes trans α=β double bond. This problem is solve by the reaction of enoyl‐CoA  isomerise, which allows the β oxidation proceeds.  Problems 2 – Δ4 double bond  In the case of linoleic acid β oxidation process, the position of ω‐6 double bond (or Δ4 double bond in the β  oxidation intermediate), impose another spatial hindrance for the enzyme reactions. Here, the presence of  Δ4 double bond renders EH inactive towards the α=β bond.   Solution for Δ4 double bond  2,4 di‐enoyl is converted to 3‐enoyl by NADPH‐dependent di‐enoyl‐CoA reductase, and the resulting 3‐ enoyl‐CoA is isomerized to 2‐enoyl‐CoA by an isomerise reaction. The 2‐enoyl‐CoA contains the α=β double  bond that is recognizable by EH.  Thus in summary, β oxidation of unsaturated fatty acids is achieved with the help of additional reductase  and isomerise to overcome spatial hindrance imposed by double bonds.  β Oxidation in peroxisomes  As mentioned earlier, peroxisomes have been recognized as an  important subcellular organelle for β  oxidation of fatty acids (and for cholesterol biosynthesis as well; see below). The name of peroxisomes is  created because reactions occurring in these organelles generated oxygen peroxide (H 2O 2.   Because peroxisomes do not contain the electron transport system for generation of ATP through oxidative  phosphorylation, β oxidation of fatty acids in peroxisomes does not generate much energy. Rather, the  main function of peroxisomes in β oxidation is to shorten the fatty acyl chains because peroxisomes possess  ACS for very long chain fatty acids.  FADH  2olecules generated in peroxisomes are converted into H O  and n2t 2tilized for ATP generation.  NADH and acetyl‐CoA generated in peroxisomes are transported to mitochondria for energy production.  Peroxisome biogenesis disorders  There are many genetically inherited diseases related to abnormal biogenesis of peroxisomes or to  defective peroxisome‐located proteins, such as Zellweger syndrome and neonatal adrenoleukodystrophy,  to name a few. Currently, there is no effective medication to treat peroxisome diseases. Patients with    6    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  peroxisome diseases suffer from neurological disorders as a consequence of abnormal fatty acid  catabolism.   Peroxisome proliferator‐activated receptor (PPAR)  A group of compounds named fibrates have been found to have the ability to induce peroxisome  proliferation, thus enhance β oxidation of fatty acids. Many manufactured fibrates have been used to treat  high blood cholesterol and/or triacylglycerol (clinically termed hypercholesterolemia and  hypertriglyceridemia).   It was discovered that these “peroxisome proliferator” compounds induce peroxisome proliferation by  activating transcription of a group of genes that are essential for peroxisome biogenesis. Transcription of  these genes is achieved by PPAR that are termed transcription factors, which are  proteins that can  specifically interact with the promoter region of genes and turn on gene transcription.   Many compounds can act as a ligand for PPAR, such as Rosiglitazone and Pioglitazone that have been used  clinically to treat insulin resistance and type‐II diabetes.   Ketogenesis  During starvation, the adipose tissue releases fatty acid into the blood stream, which is transported into  muscle for energy (β oxidation) and into the liver for a unique process termed ketogenesis.  The liver has a set of enzymes that can convert acetyl‐CoA (generated from β oxidation) to a group of  compounds collectively termed “ketone bodies.”  This happens under conditions where fatty acid β  oxidation becomes a major source for energy (e.g. during starvation). The ketone bodies include  acetoacetate, β‐hydroxybutyrate, and acetone.  Acetoacetate synthesis overview  Two acetyl‐CoA molecules in the mitochondria of the liver are condensed to form acetoacetyl‐CoA,  catalyzed by thiolase (or also called acetyl‐CoA acetyltransferase). This enzyme is the one that catalyzes the  reversible thiolysis reaction in fatty acid β oxidation.   The resulting acetoacetyl‐CoA is further condensed with another acetyl‐CoA molecule to form HMG‐CoA,  catalyzed by HMG‐CoA synthase.  Subsequently HMG‐CoA is cleavage into acetoacetate and acetyl‐CoA, catalyzed by HMG‐CoA lyase.   Reduction of acetoacetate to form β‐hydroxybutyrate  Acetoacetate can either by reduced to β‐hydroxybutyrate in the mitochondria, catalyzed by an NADPH‐ dependent dehydrogenase, or else released into the blood stream where it can be converted into ketone  through spontaneous decarboxylation (no enzyme involved).     7    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013    Biological functions of ketone bodies  As mentioned above, ketone bodies are generated under starvation and are utilized for energy  consumption by the brain. [Unlike muscle or other cell types, the brain cells are unable to absorb fatty acid  directly.]  Because of the acidic nature of ketone bodies, excessive ketogenesis results in acidification of the blood  clinically known as hyperketonemia or ketoacidosis. It has been known for long that diabetic patients often  develop hyperketonemia. The reason for this is the inability to utilize carbohydrate as the energy fuel under  diabetic conditions thus extensive β oxidation ensures.      8    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  2. Fatty acid and triacylglycerol synthesis  Overview of fatty acid synthesis  Like fatty acid degradation, the biochemical reactions involved in fatty acid synthesis also utilize acetyl‐CoA  as an intermediate. However, unlike β oxidation in which C2 unit (in the form of acetyl‐CoA) is successively  removed from a fatty acyl chain, addition of C2 unit onto  fatty acyl chain during synthesis is rather involved.  Here, the C2 unit is not directly added onto the elongating fatty acyl chain in the form of C2 per se. Rather,  the C2 unit is added onto the acyl chain through a C3 intermediate called malonyl‐CoA, and the  condensation reaction  is coupled with a decarboxylation reaction to remove C1.  Thus the overall reaction is: C n+ C 3= C n+2+ C1   The other major difference between β oxidation and fatty acid synthesis is the enzymatic machinery  involved in the respective reactions. The mammalian FAS (fatty acid synthase) is a humongous multi‐ domain, multifunction enzyme complex (a homodimer) that catalyzes up to seven consecutive reactions  responsible for the above reaction.  Fatty acid synthesis occurs in cytosol  Compartmentally, fatty acid synthesis occurs in the cytosol and thus is segregated from β oxidation that  takes place in mitochondrial matrix.   The inner member of mitochondria is impermeable to acetyl‐CoA. Transport of acetyl‐CoA out of  mitochondria is achieved through a citrate‐coupled tricarboxylate transporter system.   Tricarboxylate transport system located on the inner membrane of mitochondria  Acetyl‐CoA in the mitochondrial matrix is condensed with oxaloacetate to form citrate, catalyzed by citrate  synthase. After being transported into the cytosolic side, citrate is cleavage into acetyl‐CoA and  oxaloacetate, catalyzed by citrate lyase.   Formation of malonyl‐CoA  As mentioned above, the C2 donor for fatty acid synthesis is malonyl‐CoA (a C3 unit). Formation of malonyl‐ CoA is catalyzed by acetyl‐CoA carboxylase (ACC), a very important enzyme in the initiation of fatty acid  synthesis process.   ACC  ACC is also a multi‐domain, multi‐function enzyme that catalyzes (i) biotin carboxylation and (ii) carboxyl  group transfer reaction. Like all carboxylases, ACC contains a biotin prosthetic group involved in carboxyl  group transfer from CO 2 to substrates.    9    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013    Substrates for fatty acid synthase are ACP derivatives  Acetyl‐CoA or malonyl‐CoA are not the immediate substrates for condensation reactions. Rather, acetyl‐ CoA and malonyl‐CoA are further converted to acetyl‐ACP and malonyl‐ACP before proceeding into the  subsequent condensation and β carbon modification reactions. All of the subsequent reactions after ACC  catalyzed malonyl‐CoA synthesis are catalyzed by a single multi‐domain, multi‐function megasynthase FAS.  FAS (fatty acid synthase) and ACP  The megasynthase FAS contains six enzyme activities, which catalyze (i b) malonyl‐ACP formation, (i a) acetyl‐ ACP formation and loading acetyl group onto the KS (ketoacyl synthase) domain of FAS, (ii) C‐C bond  condensation, (iii‐v) β carbon modification, and (vi) cleavage of palmitoyl‐ACP to form palmitic acid (final  product).  The ultra‐structure of mammalian FAS has recently been determined at 3.5 A  resolution. It is a homodimer  giving an X‐shaped complex. Each subunit of FAS contains an ACP prosthetic group that functions in  carrying the elongating acyl chain and malonyl group (the extender).    Two major components of FAS catalyzed reactions  Synthesis of a palmitic acid (C16) molecule by mammalian FAS is composed of two major biochemical  components, namely (i) C‐C bond condensation, and (ii) β carbon modification. Condensation reactions are  catalyzed by MAT (malonyl‐/acetyl‐CoA‐ACP transferase) and KS (ketoacyl synthase), whereas β carbon  modifying reactions are catalyzed by KR (ketoacyl‐ACP reductase), DH (hydroxyacyl ACP dehydrogenase),  and ER (enoyl‐ACP reductase).   [Please refer to my animated PowerPoint slide shows for detailed enzymatic reactions and the involvement  of ACP in fatty acid synthesis.]  Why study FAS?  De novo fatty acid synthesis is not active in humans consuming western diet rich in fat. However it has been  shown that cancer cells exhibited high FAS activity. Selective inhibition of FAS activity may suppress  tumorigenesis and abnormal cell growth.   Regulation of fatty acid synthesis  As we have known by now, the process of fatty acid synthesis starts at the ACC‐catalyzed malonyl‐CoA  formation. Thus, it is not surprising that regulation of fatty acid synthesis is controlled at the activity of ACC.  Because of time constraint, we are unable to discuss ACC regulation in detail. Briefly, the ACC is shown to  be activated by citrate, phosphorylation, and polymerization (i.e. formation of an aggregated ACC polymer).  Conversely, ACC is inhibited by high concentrations of fatty  acid (or acyl‐CoA) and phosphorylation.    10    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013    Malonyl‐CoA is an important intermediate  The ACC catalyzed reaction generates malonyl‐CoA, which is not only an important intermediate for fatty  acid synthesis but also exerts a potent inhibitory effect on the activity of CPT1. Thus, when the fatty acid  synthesis process is active, the β oxidation process is suppressed.   Other reactions related to fatty acid synthesis  Thus far, we have discussed de novo synthesis process of a saturated fatty acid using palmitic acid (C16) as  an example. The FAS is efficient in palmitic acid synthesis but cannot synthesize fatty acids with chain  lengths longer than C16. Mammalian cells  have the enzymes that catalyze elongation reactions using  palmitic acid as a starting material. The reactions are catalyzed by the ketoacyl‐CoA thiolase (the same  enzyme involved in the last step of β oxidation) that use acetyl‐CoA as a substrate.   Formation of various unsaturated fatty acids in mammalian cells is  catalyzed by desaturase. The most  common desaturation reaction in mammalian cells is conversion from 18:0 (stearic acid) to 18:1 (oleic acid)  catalyzed by stearoyl‐CoA desaturase (SCD). The resulting double bond is in cis configuration. In humans  desaturation reactions do not occur beyond position 9 (the carbon numbers are counted  starting from the  COOH function group). Thus, fatty acids with double bonds at position 12 or 15 are acquired mainly from  diet. The fatty acids with double bonds at position 12 or 15 are commonly termed ω‐3 or ω‐6 fatty acids.  Clinical studies have shown that ω‐3 or  ω‐6 fatty acids are important to human health. Because humans are  unable to synthesize ω‐3 or ω‐6 fatty acids, these fatty acids are traditionally referred as “essential fatty  acids.”  Summary – comparison of fatty acid β oxidation and fatty acid synthesis  Now we have discussed some major biochemical reactions involved in fatty acid synthesis and degradation.  There are some key distinctions between these two metabolic pathways that deserve attention.   First, β oxidation generates energy in the forms of FADH 2, NADH, and acetyl‐CoA, whereas fatty acid  synthesis requires energy in the form of NADPH. In terms of energy balance in humans, β oxidation occurs  under conditions where carbohydrate supply is inadequate (e.g. starvation or diet rich in fat), whereas fatty  acid synthesis occurs when nutrients are overly abundant.   Second, the two metabolic pathways are compartmentalized; β oxidation occurs in the mitochondrial  matrix and fatty acid synthesis in cytosol. Thus, shuttle systems are required to transport the respective  substrates into or out of mitochondria. The carnitine (CPT1) and citrate (tricarboxylate) shuttle systems are  responsible for the substrate transport.  Moreover, the  two pathways are reciprocally regulated, thus active  fatty acid synthesis would suppress β oxidation. The involvement of malonyl‐CoA and CPT1 in these  regulation processes is physiologically important in regulating fatty acid homeostasis.     11    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Third, the C 2 units utilized for fatty acid degradation and synthesis are different. In β oxidation, C  u2it is  consecutively removed from the fatty acyl chain in the form of acetyl‐CoA, whereas in fatty acid synthesis  the C 2unit is introduced to the elongating fatty acyl chain in the form of malonyl‐CoA (C ).   3 Finally, the prosthetic groups that carry acyl chain are different. In β oxidation, acyl chains are attached to  Coenzyme A (CoA), whereas in fatty acid synthesis the acyl chains are carried by ACP.   Triacylglycerol synthesis  The last a couple of decades have witnessed tremendous interests in the studies of triacylglycerol (TAG)  metabolism, chiefly because of the prevailing “epidemic” of obesity and related metabolic disorder in  developed countries as well as in developing countries. In the following section we shall describe the major  biosynthetic pathways leading to TAG and phospholipid synthesis.   The key intermediate for TAG synthesis is diacylglycerol (DAG)  Triacylglycerol contains three fatty acyl chains condensed with a glycerol molecule through ester linkages.  Thus, in mammals TAG contains the richest energy source and is abundantly stored in adipose tissues.   Formation of TAG in the cells is catalyzed by DGAT (DiacylGlycerol AcylTransferase) through condensation  of DAG and acyl‐CoA. The acyl‐CoA  utilized for TAG synthesis is derived either from de novo fatty acid  synthesis (as discussed in the preceding chapter) or else from extracellular sources (e.g. absorbed from the  blood stream).   As we shall see in the later discussions, DAG is also an important precursor for phospholipid synthesis.   Formation of DAG in the liver  The enzymatic reaction involved in DAG formation in the liver has been characterized recently. The enzyme  termed PAP (Phosphatidic Acid Phosphohydrolase) catalyzes the de‐phosphorylation of PA to form DAG.  There are at least two PAP activities existing in mammalian cells; the one that is responsible for generating   DAG (that in turn for TAG synthesis) is PAP1.   Formation of DAG in the intestine  In intestine, dietary TAG is digested into monoacylglycerol (MAG) in the digestive track, and the resulting  MAG is taken up by enterocytes. The intestinal cells contain monoacylglycerol acyltransferase that can  directly acylate MAG to form DAG.   Two PAPs in the liver  As mentioned above, there are two PAP activities in the liver. PAP1 is responsible for the generation of DAG  that is ultimately used for TAG and phospholipid synthesis. PAP1 is a cytosolic protein and can translocate  from cytosol to endoplasmic reticulum (ER) membrane. Association of PAP1 to the ER membrane results in  activation of the enzyme’s catalytic activity. Thus, the cytosolic PAP1 is catalytically inactive.     12    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  It has been shown recently that the PAP1 activity is encoded by the lipin‐1 gene Lipn1. Regulation of lipin1  gene expression and its role in lipid biosynthesis are being actively investigated in the present time.  The second PAP, termed PAP2, is an integral membrane protein located on the plasma membrane of the  cells. PAP2 also catalyzes the formation of DAG from PA. However, DAG generated from PAP2 is not  primarily used for lipid synthesis and rather is involved in signal transduction (e.g. DAG is a potent activator  of some protein kinases).  Actions of GPAT and AGPAT  Phosphatidic acid (PA) is synthesized from two consecutive acylation reactions catalyzed by GPAT and  AGPAT, respectively. The acyl‐CoA substrates are derived from, as mentioned above, de novo fatty acid  synthesis or exogenous sources (e.g. diet).   Summary of TAG synthesis  The overall reaction of TAG synthesis involves the glycerol backbone and fatty acyl‐CoA. The glycerol  backbone is derived from glycolysis, and the fatty acyl‐CoA is derived from de novo synthesis or  extracellular sources. In the TAG synthesis pathway, the step catalyzed by PAP1 is regulated. It is noted that  the TAG synthesis pathway in intestinal cells differs from that in the liver.  Locations of enzymes involved in TAG synthesis in the endoplasmic reticulum  Most of the enzymes involved in TAG synthesis are located on the ER membrane. For instance Acyl‐CoA  synthase, GPAT, AGPAT, and DGAT are all integral membrane proteins. Once exception is PAP1 (lipin1),  which is a cytosolic protein that becomes  activated only after it translocates onto the cytosolic surface of  the ER.   Destination of TAG in the cell  The final products of the synthesis, namely TAG, have two fates. One, the resulting TAG molecules are  sequestered into Cytosol in the form of lipid droplets. Two, the newly synthesized TAG are moved into the  lumen of ER. The luminal TAG is served as the precursor of very low density lipoproteins (VLDL) that are to  be secreted from the cells (see Lipoprotein Metabolism below).   Lipodystrophy  Lipodystrophy is characterized by abnormal loss or absent of fat tissues in the body. Two hereditary forms  of lipodystrophy are caused by mutations in the genes coding for TAG biosynthesis. The Bernadinelli‐Seip  ‐/‐ lipodystrophy is linked to mutations in the AGPAT gene, and the fatty liver dystrophy (fld ) is associated  with deficiency in lipin1.      13    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  3. Phospholipid biosynthesis  Phospholipid synthesis  The terminology “phospholipids” describe a group of diglyceride‐based lipids containing a phosphate group  and a small organic molecule. The most common forms of the small organic molecule are choline and  ethanolamine. For these reason, sometime phospholipids are also called “glycerophospholipids.” One  exception to this nomenclature is sphingolipids, with  contains a phosphate group and a small organic  molecule, yet the backbone is sphingosine instead of glycerol. Thus in this lecture we discuss  “glycerophospholipids” and “sphingolipids” separately.  Biomembranes are a bilayer of phospholipids  The most commonly known function of phospholipids is to form a biomembrane bilayer. The inner leaflet  and outer leaflet of the biomembrane should not be confused with the inner and outer membranes of the  mitochondria.  Heterogeneity of biomembranes  Before we discuss various biosynthetic pathways for phospholipids, let’s first familiarize with the concept of  heterogeneity of biomembranes (which are composed of different phospholipids).  There are four aspects of membrane heterogeneity.   1. The phospholipid composition of the two leaflets of a single membrane is different. Thus, phospholipids  present on the inner leaflet are structurally different from those on the outer leaflet. This asymmetric  distribution of phospholipids on the membrane is important for various biological functions.   2. The phospholipid contents of different cells are different.  3. Within the same cells, phospholipid compositions of different intracellular membranes are different.  4. On the same plane of membrane, there are specialized micro‐domains that are rich in certain type of  phospholipids.  Now let’s look at some examples for each of the four aspects.  Asymmetric distribution of phospholipids cross the membrane bilayer  The most well known example for membrane phospholipid asymmetric distribution is the data obtained  from studies with red blood cell membranes. Although the total phospholipid contents associated with  each leaflet, not surprisingly, are identical, the outer leaflet is rich in phosphatidylcholine and  sphingomyelin whereas the inner membrane is rich in phosphatidylethanolamine. Strikingly, the outer  membrane is entirely devoid of phosphatidylserine. Such an asymmetric distribution of phospholipids has  also been observed for the plasma membrane of other cell types.     14    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Interestingly, the location of phosphatidylserine with the inner leaflet of the bilayer appears to be  important for normal cell function. It has been observed that when the cell undergoes programmed cell  death (a process termed apoptosis), phosphatidylserine becomes abnormally presented on the outer leaflet  of the plasma membrane.  Different cells have different phospholipid composition  The phospholipid composition of red blood cells is different from that of myelin cells (see Table present in  PowerPoint slide). Bacteria E. coli do not have phosphatidylcholine but are rich in  phosphatidylethanolamine and phosphatidylglycerol, the later is barely detectable in mammalian cells.   Lipid composition of various intracellular membranes is different  With a single cell, the lipid composition of different intracellular membranes is also different. The distinct  lipid composition of intracellular membranes is achieved through directional intracellular trafficking of  lipids from the site of synthesis to a final destination. For instance, cholesterol is synthesized in  peroxisomes together with endoplasmic reticulum (see Biosynthesis of Cholesterol), and is transported to  the plasma membrane. Thus, cholesterol is highly enriched in plasma membrane of all mammalian cells.  Phosphatidylcholine synthesis occurs in endoplasmic reticulum whereas sphingomyelin in the Golgi  apparatus. Thus, ER and the Golgi apparatus are rich in phosphatidylcholine and sphingomyelin,  respectively.   Specialized lipid microdomains on the same plane of biomembrane  It has been postulated that phospholipids on the same plane of biomembrane are not homogenously  distributed. Rather, certain lipid species tend to form clustered microdomains with distinct physical and  biochemical properties. These lipid microdomains, known as “lipid rafts,” are rich in cholesterol and  sphingolipids (e.g. sphingomyelin) and contain a unique group of proteins involved in cell signal  transduction.   Intracellular lipid trafficking and regulation, and the functional role of lipid rafts are areas under active  investigation in cell biology.  Now let’s learn some biochemical pathways that are responsible for biosynthesis of the major  phospholipids in mammalian cells.  The glycerophospholipids biosynthesis – the Kennedy pathway  The Kennedy pathways for the respective phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine biosynthesis  share many features in common. The three reactions involved are (i) activation of the head groups  catalyzed by kinase, (ii) formation of CDP‐containing intermediates, and (iii) transfer of phosphorylated  head groups to DAG.     15    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013    Activation of ethanolamine or choline  These reactions are catalyzed by ethanolamine kinase and choline kinase, respectively. The reactions  required ATP.   Formation of CDP‐ethanolamine and CDP‐choline  This reaction is catalyzed by CTP:phosphoethanolamine cytidylyltransferase (ET). Note it is CTP that  participates in this synthetic pathway. [Formation of CDP‐choline is not shown on the PowerPoint slide. As  an exercise, students can draw CDP‐choline formation by themselves.]   Transfer of phosphoethanolamine to DAG  This reaction is catalyzed by CDP‐ethanolamine:diacylglycerol phosphoethanolamine transferase (EPT).  [Formation of phosphatidylcholine is not shown on the PowerPoint slide. As an exercise, students can draw  PC formation by themselves.]  Summary: synthesis and interrelationship between PC, PE and TAG synthesis  The Kennedy pathways for PC and PE synthesis intersect with the de novo TAG synthesis pathway at the  intermediate DAG, which is the precursor for PC, PE and TAG synthesis.  The PE methylation pathway for PC synthesis  In the liver, there is a unique PE methylation pathway through which the ethanolamine group is  successively methylated to become choline. The methyl group donor for the three consecutive methylation  reactions is S‐adenosylmethionine (SAM). In mammals, one enzyme, termed phosphatidylethanolamine  methyltransferase (PEMT) catalyzes the three methylation steps, during which PMME  (phosphatidylmonomethylethanolamine)  and PDME (phosphatidyldimethylethanolamine) are two  intermediates.   The relative contribution of CDP‐choline pathway and PE methylation pathway to PC synthesis in the liver  The enzyme PEMT is highly expressed in the liver. PEMT activity is barely detectable in non‐hepatic cells. It  has been estimated that approximately 30% of total liver PC is synthesized via the PEMT pathway, and the  remainder is derived from the Kennedy pathway (or the CDP‐choline pathway).  Recently studies with genetically modified mice showed that the CDP‐choline pathway and the PE  methylation pathway are functionally distinct. Thus, inactivation of one pathway is not necessarily  compensated by the other.  The base‐exchange pathway for phosphatidylserine synthesis  Phosphatidylserine synthesis in mammalian cells is achieved by “swapping” the head group of  phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine with serine. This reaction is catalyzed by PS synthase‐1    16    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  and PS synthase‐2, respectively. [The PS synthase‐1 catalyzed base‐exchange reaction using  phosphatidylcholine as a substrate is not shown on the PowerPoint slide.]  Locations of enzymes involved in PC synthesis in the endoplasmic reticulum  The enzyme PEMT involved in PE methylation reactions for PC synthesis resides in the endoplasmic  reticulum as an integral membrane protein.   For the Kennedy pathway, the last PC synthesis reaction catalyzed by CPT (CDP‐choline:diacylglycerol  phosphocholine transferase) occurs on the ER membrane. The enzyme CPT is an integral membrane  protein. The location of this reaction makes sense because both the substrate DAG and the product PC are  membrane bilayer constituents.   The other substrate for CPT catalyzed PC formation is CDP‐choline, which is a soluble compound that  does  not bind to membranes. CDP‐choline is synthesized from CTP and phosphocholine; both are also soluble in  the cytosol. Formation of CDP‐choline is catalyzed by CTP:phosphocholine cytidylyltransferase (CT), which is  activated by translocation from cytosol to ER membranes. [Recall similar enzyme activation mechanism  occurs for PAP1 in TAG biosynthesis.] The cytidylyltransferase catalyzed CDP‐choline formation is the rate‐ limiting step in the Kennedy pathway. For this reason, the Kennedy pathway is also known as the CDP‐ choline pathway.  Formation of phosphocholine is catalyzed by the cytosolic enzyme choline kinase (CK).  It is clear that the machinery for phospholipid synthesis is arranged in such an order that brings soluble  substrates into an insoluble environment.  Sphingophospholipids  Sphingophospholipids are a group of phospholipids whose backbone is not glycerol but rather a  sphingosine.  Sphingosine structure  Sphingosine is synthesized from condensation of palmitoyl‐CoA and serine.   Biosynthesis of ceramide and intermediates  Ceramide is an important precursor for sphingolipid synthesis. Thus, it is essential to understand how  ceramide is synthesized.   Ceramide synthesis goes through the formation of sphinganine, which is achieved through two reactions. It  starts at decarboxylative condensation between serine and palmitoyl‐CoA, catalyzed by SPT (serine  palmitoyltransferase), to form ketosphinganine. SPT is an integral membrane protein located in the ER.  Ketosphinganine is subsequently converted to sphinganine, catalyzed by the NADPH‐dependent KSR  (ketosphinganine reductase). KSR is also located in the ER.   17    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013    Synthesis of N‐acyl derivatives of sphinganine  The resulting sphinganine can be acylated to form dihydroceramide (also called N‐acylsphinganine), a  reaction catalyzed by ceramide synthase (CerS). The mammalian CerS1 is highly selective for stearoyl‐CoA  and formation of C ‐18ihydro)Cer. There are other CerS that are specific for different acyl chains (e.g. C16,  C20, and C24). CerS is located in the ER.  Desaturation of dihydroceramide  The last step in ceramide synthesis is the desaturation of dihydroceramide to introduce 4,5‐trans‐double  bond. The enzyme catalyzing this reaction is dihydroceramide desaturase (DES). DES is an ER enzyme. In  Voet and Voet, the enzyme is designated dihydroceramide reductase (p. 974). The enzyme requires FAD as  a cofactor.  Ceramide is a precursor for sphingomyelin synthesis  Sphingomyelin is synthesized by transferring phosphocholine from phosphatidylcholine to ceramide by SMS  (sphingomyelin synthase). This reaction liberates DAG. The SMS is an integral membrane protein located in  the Golgi apparatus. Thus, ceramide must be transported from ER to Golgi for sphingomyelin synthesis.  Sphingomyelin has a high affinity for cholesterol and is located on the plasma membrane.   Ceramide is also a precursor for sphingoglycolipids synthesis  Sphingoglycolipids in mammalian cells  contain O‐linked carbohydrate groups, mainly glucose, galactose, N‐ acetylgalactosamine (GalNac), and sialic acid. The sugar moieties are transferred from sugar nucleotides  such as UDG‐Glc, UDP‐Gal, and CMP‐sialic acid. The mammalian cells possess enzyme machinery that is  responsible for the synthesis of a large variety of sphingoglycolipids with  different sugar chains.   Biosynthesis of simple sphingoglycolipids ‐ cerebrosides  Cerebrosides are the simplest sphingoglycolipids that contain one sugar moiety of either glucose (GlcCer) or  galactose (GalCer). The enzymes catalyzing the reactions are UDP‐Glc: ceramide glycosyltransferase (CGlcT)  and UDP‐Gal: ceramide glycosyltransferase (CGalT), respectively.   GlcCer is synthesized on the cytosolic side of the ER and Golgi apparatus, and GalCer is synthesized in the  lumen of the endoplasmic reticulum. CGlcT knockout is embryonic lethal in mice.  Biosynthesis of complex sphingoglycolipids ‐ globosides and gangliosides  After GlcCer molecules are made on the cytosolic side of the ER, they are “flipped” into the lumen and  transported to the Golgi apparatus because complex sphingoglycolipids are synthesized in the lumen of  Golgi apparatus. The flip of GlcCer across the membrane is facilitated by a GlcCer flippase.  Within the Golgi lumen, GlcCer undergoes a series of reactions to form globosides and gangliosides.     18    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013    Summary: Sphingolipid metabolism  Sphingophospholipid has only one species that is sphingomyelin. Sphingoglycolipids are a group of mono‐  or oligo‐saccharides O‐linked to ceramide. These glycolipids are synthesized in the Golgi lumen and  eventually are presented on the plasma membrane. The plasma membrane lipid rafts are rich in  sphingoglycolipids. Research concerning “sphingoglycolipidomics” (an approach to determine  systematically the complex sphingoglycolipids in the cells) is a new frontier that is gaining increased interest  in analytical biochemistry community.     19    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  4. Biosynthesis of cholesterol  Studies on the biosynthesis of cholesterol and its regulation are probably one of the most fascinating areas  in lipid metabolism. Not only because the biosynthetic processes involved in the synthesis of this 27‐ carbone compound and it precursor, metabolites, and derivatives are complex and intriguing, but also  because the abnormalities in these processes can lead severe consequences to human health. It is known  for long that high cholesterol content in the blood stream and vasculature is associated with increased  incidence of premature coronary artery diseases. Thus, extensive research interest has been focused on the  understanding of regulatory mechanisms responsible for cholesterol  homeostasis in humans.   Biological function of cholesterol  The plasma membranes of mammalian cells are rich in cholesterol. Location of cholesterol on the plasma  membrane ensures direct interaction with lipoproteins and blood cells in the circulation, which facilitates  cholesterol mobilization from one part of the body to the others. Although many cell types in humans are  able to synthesis cholesterol to some extent, the liver synthesizes by far the highest quantity of cholesterol.  Cholesterol synthesized in the liver are either secreted in the form of lipoproteins or dissociated from the  plasma membrane through cell surface transporter‐facilitated efflux. The acceptors for the cholesterol  effluxed from the cells are lipoproteins in the circulation. Thus, cholesterol is also a major constituent of  lipoproteins in the blood stream.  The lipoprotein‐carried cholesterol molecules are mostly delivered to organs that are responsible for  steroid hormone synthesis. These organs, known as steroidogenic, include adrenal tissue, testis, and  ovaries.   Additionally, cholesterol is the precursor for bile acid synthesis in the liver as well.   Cholesterol is a structural component of plasma membranes  Cholesterol molecules, together with sphingolipids (sphingomyelin and sphingoglycolipids), are rich in the  plasma membrane lipid rafts. Often the lipid rafts contain a protein called caveolin and forms a membrane  invagination. These invagenations are termed caveolae (small caves). The biological functions of caveolae  are under intense investigation currently. It has been hypothesized that these cholesterol‐rich membrane  entities may act as a portal through with cholesterol entrance and export take place. It has also been  suggested that caveolae play a  role in signal transduction because many signal receptor proteins (e.g. cell  growth factors) are located within caveolae.   Cholesterol and cholesteryl ester are constituents of lipoproteins  Lipoproteins are a group of macromolecules circulating in the blood stream that are composed of various  proteins and lipids, such as cholesterol and cholesteryl esters. Detailed information regarding metabolism  of cholesterol associated with lipoproteins will be discussed in next lecture.      20    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Cholesterol is the precursor for bile acids  The bile acid synthesis occurs mainly in the liver through a series of biochemical reactions with cholesterol  as the precursor. We shall briefly discuss bile synthesis in this class, but shall not discuss steroid hormone  synthesis in various steroidogenic tissues.  Cholesterol biosynthesis pathway  The building block of cholesterol synthesis is acetyl‐CoA, the same compound used for de novo synthesis of  fatty acids. Earlier studies showed that all the carbon atoms in cholesterol are derived from acetate. The  coenzymes used for cholesterol synthesis is NADPH, also the same used for fatty acid synthesis. Thus,  regulation of cholesterol synthesis shares many similarities with that of fatty acid synthesis (as to be  discussed in the next lecture).  Acetyl‐CoA, the precursor for cholesterol synthesis  The overall biosynthetic pathway for cholesterol biosynthesis is composed of three major stages. First,  acetyl‐CoA (C2 unit) is condensed with two other acetyl‐CoA molecules to form isoprenoid intermediates  (C5 unit). The resulting isoprenoid intermediates are further condensed with each other to form squalene  (C30 unit). The squalene is then cyclised and further modified to form cholesterol (C27 unit).   Two intermediates, namely HMG‐CoA and mevalonate, are the substrate and product of  the enzyme HMG‐ CoA reductase that catalyzes the rate‐limiting step for the entire cholesterol biosynthetic pathway. For this  reason, the cholesterol synthesis pathway is sometimes known as “the HMG‐CoA pathway” or “the  mevalonate pathway.”  From acetyl‐CoA (C2) to isoprenoid intermediates (C5)  st The overall reactions during the first stage of cholesterol synthesis involve C2 + C2 = C4 (1  condensation),  C4 + C2 = C6 (2 nd condensation), and C6 –C1 = C5 (decarboxylation). The two consecutive condensation  reactions produce HMG‐CoA, which are identical to the reactions we had encountered in Ketogenesis.  However, the enzymes involved in ketogenesis are located in the mitochondria, whereas the enzymes  involved in cholesterol synthesis are located in the cytosol and  peroxisomes.   HMG‐CoA reductase  The most important enzymatic reaction during the first stage of cholesterol synthesis (C2‐to‐C6) is catalyzed  by HMG‐CoA reductase, which converts HMG‐CoA into mevalonate with reduction by NADPH. This reaction  is the rate‐limiting step in the entire cholesterol biosynthesis pathway.   HMG‐CoA reductase is an integral membrane proteins located on the ER and peroxisomal membranes (not  in mitochondria). The enzyme is composed of two domains – the N‐terminal transmembrane domain and  the C‐terminal catalytic domain facing cytosol. The transmembrane domain plays a role in sensing the  intracellular cholesterol content and therefore  regulates the enzyme activity. For instance, when the  cellular cholesterol concentrations are high, the HMG‐CoA reductase becomes very unstable and is rapidly    21    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  degraded (to prevent further cholesterol synthesis). It appears that the transmembrane domain of HMG‐ CoA reductase can “sense” the cholesterol levels in the ER membrane.  The HMG‐CoA reductase is also subjected to regulation at gene transcription level in response to cellular  cholesterol levels. This aspect of regulation will be discussed in the next lecture.  Formation of isoprenoid intermediates  Mevalonte is decarboxylated to become C5 isoprenoid intermediates. This reaction involves (i) activation of  mevalonate to form phosphoryl‐mevalonate and (ii) subsequent decarboxylation. The resulting isoprenoid  product is isopentenyl pyrophosphate (IPP). IPP can be isomerized into dimethylallyl pyrophosphate  (DMAPP).  Polymerization of isoprenoid to form squalene  The isoprenoid intermediates, namely IPP and DMAPP, subsequently undergo through three consecutive  condensation reactions to form squalene. The overall reactions during this second stage of cholesterol  synthesis involve C5 + C5 = C10, C10 + C5 = C15, and C15 + C15 = C30, which are catalyzed by prenyl  transferase.  Structure of phosphorylated isoprenoids  Structurally, the O‐linked pyrophosphate end of isoprenoids is called “head,” whereas the opposite end is  “tail.” Condensation of IPP and DMAPP is achieved through a process described as “head‐to‐tail” linkage.  The resulting C10 unit is termed geranylpyrophosphate (geranyl‐PP).   One geranyl‐PP can be condensed with another isoprenyl‐PP to form a C15 unit designated  farnesylpyrophosphate (farnesyl‐PP). Farnesyl‐PP is an important intermediate of the HMG‐CoA pathway,  and is the precursor of many important biosynthesis reactions (see below).   Head‐to‐head condensation of two farnesyl‐PP molecules to form squalene  In the next condensation reaction, two farnesyl‐PP molecules are joined through “head‐to‐head” linkage  with reduction by NADPH to form a C30 unit designated squalene. Squalene is rich in shark liver oil, hence  its name.   Up to this stage (i.e. formation of squalene), enzymes involved in the “pre‐squalene” synthesis reactions  are all located in the peroxisomes (with some also present in the ER and cytosol).   Alternatively, one farnesyl‐PP (C15) can be condensed with another isoprenyl‐PP (C5) to form  geranylgeranylpyrophosphate (C20 unit). (Function of geranylgeranyl‐PP is discussed below).  From squalene (C30) to cholesterol (C27)   The subsequent reactions involved in the third stage of cholesterol synthesis, including cyclization of  squalene to form lanosterol and eventually cholesterol, are all taking place in the ER.    22    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  The first reaction of the third stage cholesterol synthesis is the addition of an oxygen atom to squalene to  form 2,3‐oxidosqualene. Cyclization of oxidosqualene gives rise to lanosterol, which in turn is converted  into cholesterol through a series of reactions in which three carbon atoms are removed.  Cholesterol and isoprenoids are precursors of other compounds  As mentioned earlier, cholesterol is an important precursor for the synthesis of bile acids and steroid  hormones. In the skin cells, cholesterol is also an important precursor for the synthesis of vitamin D.   The neutral lipid cholesteryl ester is formed by acylation of cholesterol at the 3‐OH group. This reaction is  catalyzed by at least two enzymes in the cells and in the blood stream, respectively (see next lecture).  Farnesyl pyrophosphate (farnesyl‐PP) probably is one of the most important intermediate generated by the  HMG‐CoA pathway that plays a role in a variety of biological events. Here we describe two reactions  involving farnesyl‐PP, namely protein isoprenylation and dolichol‐mediated protein glycosylation.  Isoprenylation of proteins  It has been discovered that some cytosolic proteins can become membrane‐associated through a covalent  linkage with a hydrophobic isoprenyl group. These proteins, notably the G proteins that involved in signal  transduction, can be isoprenylated and rendered to plasma membrane‐anchored.   Isoprenylation usually occurs at the cysteine residue near the carboxyl termini of a protein. The isoprenyl  donor can be either a farnesyl or else a geranylgeranyl group.  Geranylgeranyl‐PP is formed, as mentioned above, through condensation of one farnesyl‐PP molecule with  one isoprenyl‐PP molecule.  Dolichol pyrophosphate glycoside  Farnesyl‐PP is also a precursor for the formation of dolichol‐PP glycoside. Mammalian cells produce dolichol  with ~20 isoprene units. The pyrophosphate group of dolichol is attached with carbohydrate moieties.   What does dolichol do?  Dolichol is a component of the protein N‐linked glycosylation machinery. Many membrane proteins and  secretory proteins are N‐glycosylated during translation, during which a group of carbohydrates are  covalently linked to the amide nitrogen of asparagine (N) side chain. The donor saccharide groups are  assembled on the dolichol molecule that is anchored in the  ER and Golgi membranes. The assembly of  initial several saccharides occurs on the cytosolic side of the ER membrane. The nascent dolichol glycoside  is “flipped” into the luminal side of the ER where additional saccharides are added. The polysaccharide  group eventually is transferred onto the target polypeptide by oligosaccharyltransferase (OST) within the  ER lumen.   The N‐linked glycosylation is part of the “quality control” mechanism for proper folding of proteins during  and after translation.    23    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Regulation of cholesterol metabolism  The concept of cholesterol homeostasis describes a metabolic balance between synthesis, utilization,  transportation, and excretion. From a single cell point of view, cholesterol homeostasis is achieved by at  least five interdependent processes. They are (i) de novo synthesis via the HMG‐CoA pathway, (ii) storage in  the form of cholesteryl ester, (iii) uptake from extracellular sources, (iv) excretion by converting into bile  acids, and (v) exported via a process termed “cholesterol efflux.”  Storage of cholesterol in an esterified form  Excess cholesterol in the cells is cytotoxic. The cells can convert cholesterol to an esterified form, namely  cholesterol  ester and store it in the cytosol or secret it as lipoproteins. Esterification of cholesterol in the  cells is achieved by the action of acyl‐CoA: cholesterol acyltransferase (ACAT). ACAT is an integral  membrane protein located in the ER.  Conversion of cholesterol to bile acids  Although mammalian cells have an elaborate machinery to synthesize cholesterol de novo from acetyl‐CoA,  the cells do not have the capacity to degrade cholesterol or to use it as energy source. Thus, the resulting  cholesterol is removed from the body in the form of its derivative bile acids. The body makes approximately  800 mg of  cholesterol daily and half of which is used for bile acid synthesis.  Conversion of cholesterol to bile acids occurs in the liver, and the resulting bile acids are released from the  liver and stored as bile in gall bladder. Typical bile composition in mammalian gall bladder consists of 12%  bile acids, 4% phospholipids (mainly phosphatidylcholine), and 1% unesterified cholesterol, and the  remainders are water and some proteins. The “free” bile acids can be covalently linked to one of the two  amino acids (either taurine or glycine) to form “conjugated” bile acids. Taurine was originally identified in  ox bile, hence its name.   Hydroxylation at 7α and 12α positions  The first step in converting cholesterol to bile acid is 7α hydroxylation catalyzed by cholesterol 7α  hydroxylase (the gene of which is termed CYP7A1). Bulk of the bile acids made by the liver is initiated by the  CYP7A1 action, thus the output of bile acids is correlated with the CYP7A1 activity. The expression of  CYP7A1 in the liver is regulated by many factors, one of which is dietary lipid. For instance, feeding animals  with cholesterol‐rich food increases bile acid synthesis, which is attributable to the rise in CYP7A1 activity.  Saturation of the 5.6 double bond and epimerization of the 3β‐OH group  The epimerization of 3β‐OH to 3α‐OH places all the hydroxyl groups of the bile acid molecule on the same  side of the steroid nucleus plane. Positioning of these OH groups renders bile acid molecules more  amphipathic (i.e.  both hydrophobic and hydrophilic). The amphipathic nature of bile acids facilitates their  interaction with dietary fat and promotes digestion.    24    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Shortening of side chain  The bile acid molecule contains 24 carbons instead of 27. The chain shortening occurs in peroxisomes.  Uptake of extracellular cholesterol is mediated by the LDL‐receptor  Cells can acquire cholesterol from extracellular sources such as lipoproteins containing cholesterol and  cholesteryl ester. The low density lipoprotein (LDL) is rich in cholesterol and serves as the major source of  extracellular cholesterol circulated in blood stream. The LDL receptor is responsible for the uptake of  extracellular cholesterol. The LDL receptor‐mediated cholesterol uptake, as well as “cholesterol efflux,” will  be discussed in the lecture “Lipoprotein Metabolism.”    25    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  5. Lipoprotein metabolism  The objectives of the “Lipoprotein Metabolism” lecture are to introduce fundamental concepts and  knowledge about (i) structure of the major plasma lipoprotein classes and their respective functions, and  (ii) lipoprotein receptors involved in formation and catabolism of lipoproteins.  Lipids exist in various forms in an aqueous solution  When amphipathic lipids, such as phospholipids, are present in an aqueous environment, they can form  liposome vesicles or micelles. Liposome vesicles are bilayers of phospholipids with the polar head groups of  the phospholipids exposed to and the apolar acyl chains sequestered from the aqueous medium. Micelles  are monolayers of phospholipid.   If both neutral lipids and amphipathic lipids are present, they can form microemulsions in which the neutral  lipids forming a core that is surrounded by a monolayer of amphipathic lipids.  Lipoproteins are microemulsions  Typical  lipoproteins  are  composed  of  a  monolayer  of  amphipathic  phospholipids  (embedded  with  cholesterol and amphipathic α helical proteins called apolipoproteins) on the surface and a core of neutral  lipids, mainly CE and TAG. Classically lipoproteins are separated according to their relative buoyant density  by density ultra‐centrifugation, hence the names of “very‐low‐density” “low‐density” and “high‐density”  lipoproteins.  Disk‐shaped and spherical lipoproteins  The lipoprotein microemulsions can exist in both spherical and discoidal forms. The great majority of  plasma lipoproteins are spherical microemulsions that are stabilized by apolipoproteins. Most of the  apolipoproteins are also amphipathic in nature, thus allowing them to associate with lipids and rendering  lipoproteins soluble in aqueous solutions. Some lipoprotein particles do not contain neutral lipids and thus  assume a discoidal shape. In these particles, the apolipoproteins are situated on the circumference of the  disc and thus shield the apolar moieties of the lipids from the aqueous environment.  TAG‐rich lipoproteins  Although lipoproteins are classically classified according to their buoyant densities, this definition does not  reflect the lipid or protein content of the lipoproteins. Thus in this lecture, we shall precede by classifying  them into three major categories, namely the TAG‐rich lipoproteins, the cholesterol‐rich lipoproteins, and  the protein‐rich lipoproteins.  The TAG‐rich lipoproteins are synthesized in the liver and intestine in the form of VLDL and chylomicrons,  respectively. These lipoproteins have buoyant densities less than or close to that of water, because of their  large TAG content. VLDL and chylomicrons are secreted from the liver and intestine through an ER/Golgi  secretory pathway.    26    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Cholesterol‐rich lipoproteins  The cholesterol rich lipoproteins are not secreted directly from the liver or intestine. Rather, they are  formed in the blood stream during circulation. The main cholesterol‐rich lipoprotein in the circulation is  LDL, whose buoyant density is greater than water.   Protein‐rich lipoproteins  The protein‐rich lipoproteins in the blood stream are HDL (high density lipoproteins). The origin of plasma  HDL is not entirely clear. Some investigators believe that HDL are secreted directly from the liver, whereas  other believe that HDL are form in the circulation through remodelling of existing lipoproteins or through  lipid efflux from the cells (see below). The high buoyant density of HDL is attributable to its high protein  content. [Proteins are, in general, “heavier” than lipids.]  Separation of lipoproteins on the basis of their buoyant density  Fasting plasma lipoproteins can be separated into three classes according to their characteristic buoyant  densities using density ultracentrifugation. For lipoprotein preparation, blood is collected from fasting  humans (usually overnight fasting) in the presence of anticoagulant reagents such as heparin or citric acid  to prevent blood clotting. The blood cells are removed by centrifugation and the plasma samples are  subjected to ultracentrifugation to separate lipoproteins.   Electron‐microscopy of plasma lipoproteins  Examination of isolated VLDL, LDL and HDL from fasting blood sample by electron‐microscopy shows  distinct size differences.   Chylomicrons are synthesized in the small intestine and are present in the blood stream only during and  after a meal (i.e. postprandial). The amount of chylomicrons produced by the small intestine is a direct  function of the fat content in the meal. Normally, chylomicrons are rapidly catabolized and have short half‐ life in circulation. Hence, the fasting plasma does not normally contain chylomicrons.   Composition of major plasma lipoproteins  The buoyant density, protein and lipid composition of these lipoproteins are summarized in Table  “Composition of major plasma lipoproteins.” It is apparent that the buoyant density of lipoproteins is  inversely correlated to the TAG content (i.e. the more TAG, the less buoyant) and is positively correlated to  the protein content (i.e. the more protein, the denser in buoyancy).   The proteins associated with lipoproteins are called apolipoproteins  Different lipoprotein classes contain different set of apolipoproteins. VLDL synthesized in the liver contains  apoB, apoE, and apoCs. LDL contains only apoB, whereas HDL contains apoA‐I, apoA‐II and apoE.  Apolipoprotein constituents of various lipoprotein classes can be analyzed by electrophoresis using  acrylamide gels.     27    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Major type of apolipoproteins   The plasma apolipoproteins are referred to as exchangeable and non‐exchangeable according to their  relative affinity towards lipids.  Exchangeable apolipoproteins have low affinity to lipids and therefore are relatively loosely tethered to  lipid surface of lipoproteins. They can dissociate from one lipoprotein and re‐associate with other  lipoproteins in solution. Therefore, exchangeable apolipoproteins are found on different classes of  lipoproteins. For instance, apoE, an exchangeable apolipoprotein, can associate with chylomicrons, VLDL,  and HDL.  Non‐exchangeable apolipoproteins are entirely insoluble in aqueous solutions and are tightly bind to  lipoproteins.   Exchangeable apolipoproteins  ApoA‐I, apoA‐II, apoA‐IV, apoC‐I, apoC‐II, apoC‐III and apoE are exchangeable apolipoproteins. Certain  apolipoproteins have specific functions (e.g. apoA‐I and apoC‐II are co‐factors for enzymes involved in  lipoprotein metabolism; apoE are ligands for lipoprotein receptors that are located on the cell surface).   Amphipathic α‐helices in exchangeable apolipoproteins   Most of the exchangeable apolipoproteins are composed of tandem repeats of 11 or 22 amino acids  forming amphipathic  α‐helices. Each amphipathic α‐helix has one longitudinal surface that is composed of  amino acids predominantly of polar or hydrophilic nature, and the opposite surface is composed of amino  acids whose side chains are non‐polar or hydrophobic. It is the non‐polar surface of the amphipathic α‐helix  that bind to lipoproteins.  Structure of apoE  ApoE, a 299‐amino acid protein, is composed of an N‐terminal domain (residues 1‐199) and a C‐terminal  domain (residues 216‐299) that are joined by a flexible linker region. The structure for the N‐terminal  domain of human apoE, resolved by X‐ray crystallography, revealed a 4‐helix bundle. Each one of the 4  helices is presented as an amphipathic α‐helix. 3‐D representation of amino acid residues 130‐160 of apoE  shows charged residues (basic residues in blue and acidic residues in red) on the hydrophilic surface,  whereas hydrophobic residues (colored in grey) on the opposite surface.   Structure of apoC‐III  ApoC‐III is a small (79 amino acids) exchangeable protein that is also composed of amphipathic α‐helices.  The helical wheel representation  of amino acids 40‐67 of human apoC‐III reveals a typical amphipathic helix  in which the basic residues (colored in blue) are located at the interface between the polar and  hydrophobic faces of the helix whereas the acidic residues (colored in red) are in the middle of the  hydrophilic  face.     28    BCH3120  Lipid/Amino Acid Metabolism  2013  Non‐exchangeable apolipoproteins  ApoB100  and  apoB48  are  two  non‐exchangeable  apolipoproteins  present  in  plasma.  Both  proteins  are  insoluble in aqueous solutions and are tightly associated with lipoproteins from the moment of synthesis to  eventual clearance. ApoB100 is one of the longest single‐chain polypeptide and contains 4536 amino acids.  ApoB48  represents  a  C‐terminally  truncated  form  and  contains  the  N‐terminal  2152  amino  acids  of  apoB100 (hence the name because it is approximately 48% of the full‐length apoB100).   In humans, apoB100 is synthesized in the liver and is the major protein constituent of VLDL. On the other  hand, apoB48 is  made in the intestine and is the protein component of chylomicrons.   Structure of apoB100 and apoB48  ApoB100 and apoB48 are encoded by the same gene. ApoB48 is generated by a tissue‐specific mRNA  editing mechanism. In the intestine, cytosine 6666 of the apoB mRNA is converted to uridine by a  deamination reaction. This changes codon 2153 from CAA encoding glutamine to TAA, an in‐frame  translational stop codon. As a consequence, the intestine synthesizes apoB48 (2152 amino acids), a  truncated form of apoB100.  APOBEC1  The apoB mRNA editing is catalyzed by complex enzyme machinery termed APOBEC1, or apoB editing  complex. The mRNA editing represents a unique post‐transcriptional modification of genomic information  and increase diversity. In the past several years, additional APOBEC gene products have been discovered  that play a role in editing various mRNAs. Some of the APOBEC gene products are implicated in  t
More Less

Related notes for BCH3120

Log In


OR

Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


OR

By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.


Submit