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Cell bio year notes.docx

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Michael Jonz

Actin Filaments • Migration of the cell • Movements of the cell • Found in the peripheries • Occupy the cortex of the cells • Provide structure to the cell – ie RBC can squeeze into small spaces and spring  back to the regular shape Microtubules • Railroad tracks that move through a cell • Extend the entire length and transport important things through Intermediate filaments • Nails and hair Filament Construction • Formed up of smaller subunits • They are proteins • They are soluble and floating around in the cell • They grow and are recruited to form large structures • The filaments can disassemble and move to the other part of the cell, and then  they reassemble so the cell can move in a new direction • There is a common pool of subunits in which the disassembled filaments join, and  then this pool creates the new filaments at the other end • Formed from protofilaments • 13 protofilaments = a mature microtubule • weak non­covalent bonds between the subunits • there is less stability on the end because there are less bonds to this subunits and it  is not nessled like the others Nucleation • the formation of actin filaments • there is a formation of multiple subunits, called an oligomer • the lag phase, nucleation, takes a little longer • takes some time to get the oligomer made • the elongation growth phase occurs much faster • treadmilling is the equilibrium phase, the actin filaments are coming on and off. Tubulin • the soluble subunit that forms microtubules • the smallest unit is tubulin • you have two different proteins, beta and alpha tubulin • there are slight differences in their formation • they form a heterodimer • it needs GTP for energy and hydrolysis • 2 molecules of GTP bind to the subunit • the hydrolysis occurs at the + end, the other binding site is only structural • polymerization occurs at the + end Actin • a monomer, a single protein • a plus and minus end as well • uses ATP • this site is closer to the – end but it is an open site • if you take a whole bunch of these it makes a more twisted formation • the minus end of the filament is the minus end of the subunit Treadmilling and Dynamic Instability • growth/shrinkage of filament proteins • actin and tubulin catalyze hydrolysis of ATP or GTP • T or D form indicates if triphosphate or diphosphate form exists • ATP/GTP caps • Critical concentration = subunit addition equals loss • The fastest way to grow filaments without nucleation • Exploration for attachement sites and remodeling • Spatial and temporal flexibility with high turnover Treadmilling ACTIN filaments • There are constantly filaments being taken from the minus end and bring put at  the front end, but the length is not changing • At low concentration there is more addition so there is a net addition • At high concentrations there is addition at both ends • The minus end looks different than the plus end so its difficult to add to the minus  end, it is thermally unstable. • Every time the concentration drops, more addition at the plus end happens Treadmilling MICROTUBULES • It appears as though the MT are moving in that direction • They are built in such a manner that eventually the plus end is thrown off the  minus end • The length does not change Treadmilling • There is a critical concentration where the + end of the filament at which the loss  of subunits matches gain of subunits • There is no increase in length • The minus end has a hard time adding subunits here • You need a high concentration for them to be added to the – end • Treadmilling range = range at which you will observe it Dynamic Instability • If the concentration of tubulin is within the critical values, we will have stability • If it is above the critical concentration we have a build up of a GTp cap • As the concentration decreases the rate of hydrolysis catches up • We loose the GTP cao and it falls apart • A lot of tubulin goes back to the pool and we get our cap back, this is the rescue Dynamic instability Microtubules • Hydrolysis affects conformation • If we put all 13 protofilaments together in a cylinder when they are growing we  have a GTP cap • The cap is not hydrolyzed and it is straight in conformation • If it is hydrolyzed the GTP goes to GDP and it takes on a curve and falls apart Intermediate Filaments • Tetramers packed into array of 16 dimers in cross­section • Rope like appearance • Formation by spontaneous interaction • Disassembly likely regulated by phosphorylation 1) Epithelial (keratins) • Most diverse family • Strength in hair and nails 2) axonal • found in central and peripheral axons of vertebrate neurons • type L, M or H • growth, increase axon diameter Intermediate Filaments • Have rope like properties that allow it to respond to deforming forces without breaking (strong, bendable) (ex. Make up your hair, nails, skin cells) • Microtubules and actin filaments are brittle and aren't designed to sustain these kinds of forces by certain cells Intermediate filament formation 1) Starts off with 2 dimers 2) dimers form tetramer in inversed, staggered, formation 3) 2 tetramers then come together *Tetramer = soluble form • Tetramers packed into array of 16 dimers (not present in sheets, wrapped up) • Formation by spontaneous interaction • Disassemly regulated by phosphorilation • Polymerize by … and orientation • Not utilisation of ATP and GTP IF Types Epithelial: gives strength (keratins) • Most diverse family • Type 1 and 2 keratin chains • Strength in hair and nails Axonal: (neurofilaments) • Found in central and peripheral axons of vertebrate neurons • Type L, M, or H • important for growth of neurons and axons and increase axon diameter (important in propagation of action potential) Accessory Proteins • Accessory proteins modify processes (ex. Dynamic instability) • Filaments (af, mt, if) are dynamic and under control of the cell • Form higher­order structures (ex. Mitoti spindles) • Accessory proteins modify theses cytoskeletal dynamics Nucleation by GAMMA­Tubulin Protein Complex • Occurs in centrosome of animal cells and spindle pole bodies in yeast • Gamma tubulin: conserved protein, forms ring structure that helps to initiate the process of growth of microtubules and accelerates microtubule formation by nucleation (occurs as minus end) • Occurs in cytosol of plants • Microtubules then nucleate branching daughter microtubules The Centrioles & Centrosome Centrosome and centriole play a role in via gamma tubulin Centrosome: • Contains 2 cylindrial centrioles and 9 triplets of microtubules • Divides and heads to poles of the cell to form mitotic spindles (makes network with cell) Centriole • Anchored in centrosome • Organizes PCM (Pericentriolermatrix/materials: material that fills centrosome and surrounds centrioles) which helps regulate concentration of microtubules • Centrosome near nucleus • Minus ends of microtubules are anchored • Plus ends undergo rescue and catastrophe and emanate in astral configuration Nucleation of AF • Actin binding and actin related proteins • Occurs around cell periphery (cortex) where density of AF proteins is highest • Location related to AF function (cell shape, movement) • Facilitated by ABPS and ARPS (actin binding and actin related proteins) Initiation of AF (unbranched) • Initiation by formin (ABP)  ▯ Formin = dimer, responsible for correct alignment and polymerization of actin subunit  ▯More and more will be added, each subunit is added at a specific angle, forms a braided structure (formin helps it get that way) Ex. Filaments of muscle cells Initiation of AF Branches • Actin filament branching gives shape to cells (good at changing shape) • Sheet encompasses at cell periphery where we find high concentrations of actin • ARP 2 & 3 produce extensive branching, complex contains 7 proteins • Binds at minus end Control of Subunit Pools • Concentration is important since both actin and tubulin are maintained in cytosol at high concentrations where it can exceed its critical concentration (not a problem since concentration fluctuates) • Accessory protein sequesters unused subunits to stay in a pool and prevent their usage in filament growth (won't be hydrolyzed, to be used when needed) Thymosin Sequesters Actin • Thymosin sequesters, but profilin recruits actin • Thymosin makes polymerization less favourable • Profilin competes with thymosin for binding to actin monomers and promotes assembly • Whichever one is in high concentration will be integrated in the filament Stathmin Sequesters Tubulin • Stathmin binding prevents polymerization • Stathmin binds to more than one tubulin dimer and sequesters them into common pool, decreases effective concentration • Decreased pool gives catastrophe because subunit concentration is limiting, hydrolysis can catches up (lose GTP cap), microtubule shrinks MT­Associated Proteins • Several binding domains (long: MAP2, short: tau) • Bind at the sides, not at the top • Length of projecting domain can can determine packing/closeness of microtubules (see A and B) 2 types: • Tau: contributes to progression of disease (axons)  ▯Packs microtubules closer than MAP2  ▯Alheimer's disease: when tau can't bind to microtubules may be induced by hyperphosphorylated or poorly soluble tau • MAP 2: neural cell bodies AF Binding Proteins Cofilin • destabilizes by bind into sides, induces stress to subunits that can't withstand stress • treadmilling (no steady state) and turnover occurs, to reform and move them in the cell Tropomyosin • Stabilizes by binding into sides • Used for muscle contration Modifications at AF Ends Capping: binding at the ends • Effects growth and shrinkage of filament • Grows at minus end only since CapZ(+) elongation occurs only at minus end • Addition is more favourable at plus end so growth is slow • Linear relation between capped and uncapped population of filaments Modifications at MT Ends Capping in microtubules has dramatic effect on dynamic instability • MAPs help stabilize proteins  ▯act as bridge the gap between 2 neighbouring heterodimers of tubulin, promotes rescue, reduces catastrophe  ▯Result: longer, less, dynamic microtubules • Catastropin help destabilize proteins  ▯binds to sides and tip, depolymerizes, increasing catastrophe frequency  ▯Result: shorter, more dynamic microtubules Cross­Linking Proteins & AF • Forms higher­order structures  ▯How?: Spacing of 2 actin binding domains of cross­linking protein determines structure type • Major groups: Bundles or gel­forming (networks) • Bundling: tightly binds 2 actin filaments together (red regions are parts that bind with actin) • Gel forming: spaces filaments to maximize use in a space to create a network (actin isn’t as close) Actin Bundling Proteins Examples where actin filaments form high order structures • Filopodia: bundles actin (packs more and closer together) • Muscle contractions: actinin forms networks to maximize space for myosin Gel­forming Proteins • Filamin directs appropriate alignment to make network and provide structure seen in B Changes in Cell Shape during Embryonic Development Folding of neural tub during nervous system development  ▯How?: Movement of microtubules and actin filaments  ▯microtubules organize and get lengthier (cell height)  ▯Actin filaments grow at the base and shrink at apex like a triangle (rolling) Induction by Extracellular signals • there is some sort of chemical que that is received, the polymerization pushes the  cell in a new direction • with time the cell membrane protrudes and produces the pseudium • WASP = protein in the transmembrane involved in transducing a signal, it binds  the chemical, this activates Arp 2/3 complex, the actin filaments are nucleated • Profiling competes with thymicin causing regulation in the common pool of  subunits • You get a + and a – end, now we have branching at semi­degree angles • Now we have capping proteins and start to see the production of the networks that  are going to push out the membrane to allow the cell to crawl • Capping proteins regulate the length of the actin filaments • Then we have to disassemble everything via cofilin • Actin ADP is phosphorylated into ATP and profiling again Steps 1) extracellular signal 2) activation of WASP 3) nucleation and branching by Arp 2/3 4) promotion of assembly by profiling 5) elongation reduced by capping proteins 6) destabilized by cofilin and retun of subunits to the pool  Motor Proteins • use energy derived from hydrolysis of ATP to produce mechanical force • bind to cytoskeleton • produce net movement of protein or cargo ­­­ a small protein that transports  something very large.  • Myosins move along actin filaments • Kinesis move towards the plus end of microtubules • Dyneins move towards the minus end along microtubules Myosins • The head regions are always conserved • Sometimes there are 1 and sometimes 2 • The head is the catalytic core • The tail regions vary • Conventional myosin = type 2 = muscles and cytokinesis • Unconventional myosin = type 5 = organelle transport Myosin 2 • We have a head, tail and accessory region • There is 1 copy of each different types of head regions • Each is associated with a tail region • The tail regions are wrapped around each other and interact with the other tail  regions and the cargo • The catalytic region uses ATP which binds there and hydrolyzes it • The light chains are regulatory chains to regulate the motion of the catalytic  heads, they are the wrist to the hand • Light chains also amplify conformational change The Myosin Cycle 1) attachment phase – we have an actin filament, with the myosin head of the  motor, and there is no ATP bound to the myosin head. The myosin head is bound  and locked to the actin filament. Rigor mortis is because after death there is no  ATP, so the muscles are locked here.  2) Release phase – ATP binds to the myosin head and we have a conformational  change in the head away from the actin filament 3) cocked phase – hydrolysis of ATP (ATP to ADP) then there is a conformational  change towards the plus end of the actin filament 4) Force generating phase – there is weak binding of the motor to the actin  filament, release of a phosphate, which produces the power stroke, the head  moves the actin filament, and ADP is lost. Thick Filament Formation • Tail­tail interactions • Heads oriented in opposite direction • Formation of bundles in sarcomere of muscle cells • These molecules don’t really move – think of it as being stationary and the actin  filaments are being brought together The Sarcomere • M line = bundles of myosin • We also have actin filaments wrapped by tropomyosin • Cap Z = integrates with the plus end of the actin filament to prevent elongation of  the filaments • Tropomodulin = capping protein that associates with the myelin, preventing  excessive elongation • Z disc = an alpha actenin, a bundling protein, integrates the cells between  adjacent filaments to space them apart, without them we have these Z discs, this  prevents the elongation and spaces them so we can fit the M lines inside. Muscle Contraction • We need calcium • Tropomyosin is wrapped around the actin filament • Without calcium tropomyosin interferes with the binding of myosin so it cannot  interfere with the AF • It blocks the activity of myosin if there is no calcium • Calcium is released from the sarcoplasmic reticulum • Calcium binds troponin­C • This causes a conformational change in troponin­I ( a hinge that swings) • This moves troponin­T • The binding site is exposed • Myosin can bind and we get muscle contraction Myosin 2 S1fragment  • A head, tail and if you react with protease you can cut off the head and neck, and  adhere this to the glass cover slide  • Catalytic heads and the necks • This shows that they can move everywhere Contractile Ring • During cytokinesis (division of the plasma membrane) • There is a little ring that is formed from actin filament • They need a signal to form this ring • Actin and myosin make a contractile ring • 2 adjacent actin filaments and 2 adjacent myosin 2 filaments • the tails dimerize • the tails are formed right before and fall apart during • the thickness doesn’t get bigger, the idea is that they are contracting • you end up with a cleavage furrow and then it disassembles and the filaments are  redistributed Myosin 5 • unconventional • long neck region • processivity = the heads can actually work together on the same molecule because  the necks are longer, one head is always in contact with the AF and produces  hand­over­hand • carries cargo from one part of the cell to another • has 2 heads Optical trapping • you have a slide with AF adhered to it and the myosin motors are in solution • they have polystyrene beads attached to it • you can trap the bead using a laser • you can let it pull your laser and measure the fine movements • myosin moved the beads in 30­40 nm steps Kinesins • when you inject radioactive amino acids the cell makes it into proteins • these proteins are transported and we can measure the movement of the  radioactivity • there was a large amount of radioactivity because of the injection making the  bolus, but then you see the formation of the shoulder as it pushes it down the  nerve • they took microtubules and stuck them to cover slides, using squid (they have  large neurons), and added ATP to induce organelle movement • if you take away the ATP you get no movement • kinesin is the molecular motor, the protein that transports the cargo down the cell Kinesin Structure • a conserved head region • diverse tails • c terminus attaches to the cargo • most travel on MT towards the plus end • ATP binding sites are very similar • The linker region interacts with catalytic core which swings the entire structure  around, like a hinge Kinesin Cycle • Kinesin takes progressive steps • 95% of the time the heads are not attached to the AF • you have a leading head and a trailing head • it walks towards the plus end • ATP binds to the leading head causing a conformational change in head and linker  region • There is a swing and the trailing head swings in front of the leading head • ADP induces a weak binding, too weak to act against the previous ATP, which  made the conformational change • The trailing head is hydrolyzed so there is detachment and ADP leaves the leading  head, so now we are back at the beginning with ADP on the trailing head, and the  leading head starts over Myosin 2 • Attach to actin filaments • Contract muscle • Rapid power stroke • No head coordination • 5% of the time attached Kinesins • attach to microtubules • transport organelles • longer attachment • processive steps • 50% attached Dyneins • ­ end directed • microtubule motor proteins 1) cytoplasmic • dynein cannot bind directly to cargo • attachment to microtubule mediated by dynactin complex • inclusion of actin • has other accessory proteins • retrograde vesicular transport 2) Axonal  • Beating of cilia and flagella Why the cell cycle needs to be controlled • Need to occur in a specific sequence • Huge errors if it happens wrongly or out of sequence • We control it using proteins and switches CDKs • Cyclin dependent kinase • Their levels change throughout the cell cycle • Regulate DNA replication, mitosis and cytokinesis • Binds to cyclin • M cyclins have higher activity (mitosis) Cyclins • G1 and S cyclins  ▯DNA replication • S cyclins bind CDK during S phase and are needed for DNA replication • M cyclins  ▯mitosis • G1 cyclins  ▯allow to go through restriction point in late G1 phase CDKs are protein kinases • Involved in the transfer of phosphate • They phosphorylate using ATP  • Transfer the phosphate to another protein and turn it on Activating Cdk­Cyclin • To activate CDK we need cyclin and CDK activating kinase that will  phosphorylate protein kinase • So you start with an inactive CDK that is not yet bound to cyclin • Cyclin will enter as levels increase • This causes a conformational change, a t­loop • When it is phosphorylated by CAK (cdk­activating kinase) it is fully activated Inhibiting CDK • Before entering mitosis the cell must be held in a state where there is a protein  called Wee1 kinase • Wee1 kinase holds the cell here before entering the M phase • Wee1 inactivates, it phosphorylates to an inhibition site, which inactivates the  CDK. • CDC25 dephosphorylates the site that Wee1 deactivated • This reactivates CDK CKI • Inhibitors • P27 interacts with the cyclin protein and CDK and binds to the complex causing  inhibition Ubiquitin • Protein • Puts a tag on a protein if it is not needed or needs the levels to be decreased • Once it is tagged with ubiquitin it enters the proteasome where proteins are  destroyed • Its broken into its amino acids and then reused inside the cell SCF  • Ubiquitin ligase • Controls the cell cycle by leading to the destruction of some protein • These proteins are enzymes that mediate the transfer of ubiquitin to a prtein to  mark them for destruction • SCF can remove the CKI inhibitor • The CDK inhibitor protein is phosphorylated and then SCF can come and  recognize it and mediates the initiation of the multiubiquitin chain • CKI is degraded • S­CDK is not deactivated • Cell can go to S phase • Positive effect on cell cycle APC • Ubiquitin ligase • Destroys securing • Chromatids separate • Destroys M­cyclin • You have your M­cyclin and the inactive APC that is activated by CDC20 attracts  the ubiquitin multichain and then the M cyclin is degraded in the proteasome, and  the cell can leave the M phase • Positive effect on cell cycle SCF and APC are active during different stages • SCF is active during S, G2, and M phase • APC is active during G1 and M Cyclins and M phase • Cyclin levels increase in advance of M phase • M­cyclin joins CDK1 but needs to be activated • Wee1 kinase phosphorylates an inactivated site on the CDK • We are held in this inactive MCDK stage on the brink of mitosis • CDC25 is the signal to activate it – it is a protein phosphatase • CDC25 removes the phosphate from the CDK and removes inactivation • We now have active MCDK and the cell moves to mitosis Checkpoints • START checkpoint – is the environment good? • G2/M checkpoint – is all the DNA replicated and is the environment good? • Metaphase to anaphase – are all chromosomes attached to the spindle? Proceed  to cytokinesis • Checkpoints are in case something goes wrong the cell cycle pauses • If there is unreplicated DNA, cdc25 is not activated and M­cdk is blocked, cell  does not go to mitosis Chromatid Separation • Anaphase promoting complex is a ubiquitin ligase  • It degrades securing • Separase becomes active and this cleaves sister chromatids Spindle Attachment Checkpoint • If there are any chromosomes that are unattached CDC20 will not activate the  next step • What happens then is that the cell is held at metaphase and the chromatids do not  separate • Nondisjunction = chromosome that is not divided DNA damage checkpoint (G1) • Damage to DNA can occur due to xray radiation or chemical exposure • P53 is a gene regulatory protein • It modifies the gene to have an effect on the transcription • P53 is normally degraded because of mdm2 which causes ubiquination • If mdm2 dissociates from p53 then p53 stabilizes • P53 is also phosphorylated • The protein is activated • Transcription and translation is increased • You get p21 proteins Total cell mass  • Affected by the cell division and cell death • Growth factors increase synthesis • Mitogens increase cell division • Survival factors decrease apoptosis Growth factors • Needed for growth of animal cells • Increases synthesis • Decreases degradation • Extracellular signaling factors • They bind to a surface receptor on a cell and there is a transduction of the  chemical stimulus inside the cell • This affects the cell cycle • Bind to receptor tyrosine kinase • Once they come into contact with the growth factor they are pulled closer together  and the binding of the extracellular signal (growth factor) brings these two  domains closer together. • They phosphorylate each other – crossphosphorylation • Other signaling molecules are recruited and the pathways are initiated • Increase in protein synthesis • GF binds, autophosphorylation, PI3 kinase is activated, phosphorylation of PIP2  phospholipid • TOR is activated, which activates S6K, and then a ribosomal protein is activated Nerve growth factors • Rita levi­montalcini pioneered and discovered them • Used mouse sarcoma tissues that released neutrophins which induce the growth of  the nerve cells Mitogens • Extracellular signals for cell proliferation • Some growth factors are mitogens as well (PDGF and EGF) • The increase cyclin synthesis • More CDK is activated • More entry into S phase G1 restriction point • Go is where the cell is stuck potentially in the growth state, this is terminal  differentiation, this point prevents them from going into G1 • The cell has to receive a signal to move back into the cell cycle • Requires a mitogen extracellular signal • PDGF is released from platelets in the blood and this stimulates fibroblasts to  reenter the cell cycle and divide, promoting healing • Without mitogens the cell will go into G0 (ie neurons) • With mitogens the cell will renter G1 Mitogens and cell division • Ras protein is a molecular switch • When the PDGF receptor is activated, Ras becomes activated • MAP kinase is activated • This activates a gene regulatory protein • This regulates the MYC gene • MYC gene makes MYC protein, which affects the cell cycle • MYC protein activates genes that are responsible for G1 CDK and S CDK • MYC activates cyclin gene and SCF gene Abnormal Mitogenic stimulation • Increase of Ras or anything that is activated when it should not have been • This can result in cancer because the cells keep entering S phase when they  should not • P53 is normally degraded, when DNA is damaged p53 is stabilized via  dissociation and there is apoptosis • If there is too much MYC protein, p19 is activated, and mdm2 is removed from  p53, and now it is stable and active, and apoptosis occurs • In cancer p19 and p53 don’t work Survival factors • If a cell detects the extracellular signal of a survival factor it will go through the  cell cycle • It will not apoptose • Protein B kinase is activated, phosphorylated, and goes on to phosphorylate 2  more pathways • BCL2 proteins promote apoptosis, they associate with BAD and apoptosis occurs • If we phosphorylate this complex, BCL2 and BAD dissociate, and BCL2 is able  to inhibit apoptosis Apoptosis • Programmed cell death • Different from necrosis • Trauma or cytotoxicity leads to decreased ATP and sodium potassium activity, so  the cell lysis • Balance of cell division with death in adult tissues • Ie the mouse paw (where they undergo apoptosis to make the digits more clear) • A cell must undergo significant biochemical and morphological changes • Initiation of intracellular or extracellular signal • We need proteins • And we need to be able to dispose of the cell Structural changes during apoptosis • You have your normal cell • Chromatin condenses • Cytoplasm shrinks • Nucleus fragments • DNA laddering, blebbing (forming little circular blebs) • Cell fragmentation • Taken in by phagocytosis Phagocytosis • Assymetric distribution of plasma membrane is lost • Negative charged phosphatidylserine then becomes exposed on the outsde of the  cell • The cell is then marked for phagocytosis by macrophage Cell­death mutants • Caenorhabditis elegans is a nematode worm • Adult always has 959 somatic cells • 131 cells apoptose everytime • genes that encode for capsases (proteins involved in apoptosis) • gene is ced­3 Caspases • ced­3 gene • cleave essential proteins • involved in most changes during cell death • enzyme • has a cysteine residue • cleaves at aspartate site • can also cleave each other, activating on another • cleave protein kinases  ▯disrupt adhesion • cleaves lamins  ▯disassembly of nuclear lamina • cleaves cytoskeleton  ▯changes cell shape • activates CAD  ▯Dna fragmentation Procaspase activation • caspases are first procaspases • this is the inactive form • they are activated by proteolytic interactions (cleavages) with other activated  caspases The caspase cascade • an active caspsase activates others • all or nothing • amplification • proteins are cleaved 1) extrinsic pathway • procaspase activation triggered from outside the cell • cell death receptors • Fas ligand activates death receptor • Adapter proteins are recruited and procaspase activation occurs 2) intrinsic pathway • procaspase activation triggered from inside the cell • intracellular damage or loss of survival factor • BCL2 protein family  ▯BCL2 inhibits apoptosis, BAX and BAK act on  mitochondria and release cytochrome c from intermembrane space • Basically bax or bak make a complex and form a pore on the membrane of  mitochondria and cytochrome c can spill out • Cytochrome c binds with Apaf1 protein, hydrolysis of ATP occurs • CARD domain induces formation of apoptosome wheel like structure with  several apaf1 • Recruitment of procaspases occurs • CARD domains have high affinity for eachother so the wheel is formed Apoptosis in NS • Nerve growth factors • A growth factor but also a survival factory • Released by target cells • Bax is an important mediator • Growing nerve cells detect this and start growing towards the target cells • Drastic consequences if apoptosis doesn’t occur • The forebrain in the knockout mice protruded a lot MICROSCOPY 1) LIGHT MICROSCOPY • You can see bacteria and mitochondria • A compound microscope • Light originates from the user turning it on, it shines through the specimen  to the objective lens • A very bright white light source is shone through the condenser, which  focuses the light on the specimen • Can be used for live or fixed cells and tissues • For tissues you use an upright  • For cells you use inverted  ▯flip the lense with the light source, so you can  manipulate the cells without worry a) bright field ▯  uses transmitted light b) phase contrast ▯  converts phase differences into changes in brightness. You can  see a phase shift that occurs in unstained cells as light travels through and is  exploited c) Differential ▯  the light is interfered with while it is passing through the cell and  this causes contrast. The light is first separated and then gathered back together.  Allows for more definition. d) Dark field ▯  light comes in from a lateral source and not right through the  specimen. This is used to aluminate.  2) FLUORESCENCE MICROSCOPY • Instead of using white light at all wavelengths they use only very polarize  and pure light sources at specific wavelengths • You use a light source that emits once it interacts with a specimen at a  very specific wavelength • You look at one wavelength at a time • Used to detect specific molecules or ions • Antibodies can be tagged with fluorescent probes and put into a cell and it  is expressed genetically through turning on a bright light that excites only  this protein • You shine a bright light and it only excites molecules at a specific  wavelength and a photon is emitted at a longer wavelength • Energy is lost and absorbed and thus the end photon that is emitted is a  longer wavelength • Works on the principle that some molecules absorb and emit photons of  light at a specific wavelength • Absorption and emission • You can buy fluorescent molecules from a chemical supplier • Ie FITC is often bound to an antibody and you take it, put it in the cell,  and the wavelength you use to excite is blue and you see green • GFP can be genetically expressed  ▯green fluorescent protein, allows you  to labell and see cells in vivo.. LIVE SPECIMENS. • Uses a special light source – mercury lamp that emits a very bright white  light. Needs to be BRIGHT. • You have a series of filters to filter out other lights • You have the light coming in from a different source, it hits the specimen,  bounces off, and the light signal bounces back and you see it with your  eyes Tissue Preparation • Fixation  ▯the tissue is dead and it is fixed to represent a moment in time. It  crosslinks proteins and stabilizes membranes and organelles and puts everything  into a stasis. • Exposure to chemical reagents • Sectioning  ▯you have to cut sections. you end up with sectional tissue  ▯a very  thin section.  • Staining  ▯exposure to dyes Immunofluorescence • Another more recent advance • Uses immunology and fluorescent microscopy • You are inside the cell and you have a substrate on the surface of a membrane or  nucleus • It has an antigen and we use antibodies that we make and incubate the specimen  with them • Now we have a secondary antibody • We throw in the secondary antibodies and this binds to the primary antibody and  NOT the antigen • We need a secondary antibody because it amplifies the signal! 3) CONFOCAL MICROSCOPY • Uses high intensity lasers instead of mercury • You need digital cameras to see the images • The principles are like fluorescent but the source of light is different  (laser) • It can eliminate background signals and can reduce the blue and make it  more clear • This is useful for thick specimens • We use the microscope to make optimal sections and combine into 3D • Good for whole mount preparations • But its very costly • Confocal ▯  distance between the light source and the object and the object  detector • Pinholes act like a filter • Pinholes focus light at a single point on the specimen making an optical  section • All the light from the specimen passes perfectly through the pinhole and is  in focus • If something is out of focus it never makes it to the detector because the  pinhole is very fine 4) TWO­PHOTON MICROSCOPY • Newest form • Non­linear  ▯nearly simultaneous arrival of two or more photons of light  at the specimen • Allows for deep tissue imaging (light penetrates further) • absorption occurs at near IR region • very costly • multiple photons of light instead of a single photon • they interact at the same time so you get additive increase of electron  states and when you excite the molecule you increase excitation state such  that photon is emitted at longer wave length • with two­photon we get excitation only in regions where there are multiple  photons of light interacting • otherwise no image is produced • very good resolution because this interaction only occurs at one fine point • rapid high energy pulses  ▯repetitive and used to excite the specimen.  • signals are collected by the detector • beam expansion tube and scan lens focus light onto sample • no pinholes ELECTRON MICROSCOPY – much better resolution 1) Transmission electron microscopy (TEM) • thin section of tissue • embedded and plastic and you hit it with electrons and they either  pass through or bounce off • always in black and white  ▯electrons either make it or they don’t  and are scattered • you can see he inside of the cell because you are passing electrons  through the sample • bombard with electrons • you can take serial sections and make into 3D  ▯take the electrons hitting the specimen and focus on a computing screen ▯ lectrons are emitted and accelerated through the condenser lens ▯ verything happens in vacuum ▯ agnetic foils focus electron beams like a lens Preparation • takes a long time • tissue is fixed in gluteraldehyde • this removes water and replaces with alcohol • provides extra support • ultra thin sections that can’t be handled directly • placed on copper grids Immunogold EM • histochemistry • you can see if protein X is found • they used antibodies and electron microscopy to show they could show the  presence of proteins • they use gold particles because gold does not allow electrons to pass through at  the speeds and voltages used • wherever there is a protein with antibodies, there is gold attached • electrons hit this and are scattered and this shows up as electron dense area • shows up black on image 2) Scanning electron microscopy (SEM) • more for topographical features • electrons don’t pass through • you can only see surface features • scan the surface • electrons bounce off • you can get 3D images of surface structures • used for whole cells and tissues • NOT LOOKING INSIDE A CELL • you coat the cells and tissues with a heavy metal, fix it, prepare it,  put it in a chamber and it is coated with gold particles • gold doesn’t allow electrons to pass through, electrons are  scattered • detector placement allows for image generation • the electron is on the side or lateral to the specimen • the scanner changes the direction of the root of electrons as they  are thrown as the specimen ION IMAGING • looking at changes in concentrations of ions such as calcium • pH is important for enzymatic reactions • ion selective indicators  ▯give off a light signal as concentrations change. the dye  interacts with the calcium and reports changes.  Calcium imaging • sperm fertilizes the egg and there is a wave of calcium that is initiated and  propogated through the cell • prevents other sperm from fertilizing • AEQUORIN is a dye you can use to watch this • you see a change of fluorescent intensity • ratiometric  ▯if a cell is at rest, ie a neuron, there calcium that is low inside the  cell, you load it with dye, and this interacts with the calcium, ratiometric uses a  dye that if more calcium binds with it it changes its spectrocharacteristics. • acetoxymethyl ester is used ▯ allows it to be permeable to the membrane so you do   not have to inject it • ratiometric ▯  take the ratio of the amount of fluorescence given off with and  without calcium • we can see precise and define areas of calcium increase, not just a whole cell. X RAY CRYSTALLOGRAPHY • understand the structure of proteins • allowed us to see the relationship between structure and function • you need a large amount of pure crystallized hemoglobin (big issue) • if it is not pure you won’t get a good protein structure • there are spaces between parts of a protein  ▯the xrays that are bombarded  penetrate very dense material and you get penetration and defraction. • you record defraction patterns on the other side of the screen • very time consuming • need a lot of material • some proteins cant be crystalized • xray source  ▯ synchrotron • basically you bombard with xrays and you get this pattern due to diffraction and  interferences • this doesn’t look like the protein at all • you have to randomly bombard from different directions and eventually a pattern  emerges and you get your structure • tells us protein folding, groups of atoms, individual atoms, and electron density • all depends on the crysal • ion channels are not hydrophilic and were hard to crystalize, Mackinnon got a  nobel prize for this because he used antibodies to stabilize them and reduce  hydrophobicness. PROTEIN SORTING • proteins are synthesized in t
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