Class Notes (809,497)
Canada (493,753)
BIOB12H3 (30)


13 Pages
Unlock Document

University of Toronto Scarborough
Biological Sciences
Aarti Ashok

BIOB12H3S:  Cell  &  Molecular  Biology  Laboratory       Bacteriology  module  (PDF  #4)     Introduction  to  Bacteriology:   Bacteria  are  simple  prokaryotic  cells,  which  include  many  different  types  and   species.    Bacteria  live  almost  everywhere,  from  the  frozen  tundra  to  the  hot  acid   springs  of  Yellowstone  Park  where  they  live  at  pH  2  and  at  nearly  100°C.  Of  course   most  live  in  more  pleasant  environments,  such  as  the  human  digestive  system.  We   will  leave  a  formal  description  of  bacterial  cell  metabolism  and  diversity  to  the   microbiology  course.    Instead,  we  will  provide  you  with  some  information  on   bacteria  in  terms  of  what  they  need  to  reproduce,  and  we  will  acquaint  you  with   some  of  the  commonly  used  techniques  in  microbiology  and  molecular  biology.     These  techniques  will  then  be  expanded  in  upper  level  courses  in  biology.       In  this  laboratory  we  will  culture  Escherichia  coli    (E.  coli)  by  two  different  methods.     E.  coli  is  the  most  commonly  used  bacterium  in  cell  and  molecular  biology  labs,  for  it   serves  as  the  most  common  host  for  the  propagation  of  recombinant  DNA   molecules.    Many  strains  of  E.  coli  can  grow  on  a  carbon  source  (like  glucose)  in   simple  inorganic  salts.    Of  course  if  the  medium  is  more  complete,  growth  is   facilitated.    Typically,  E.  coli  is  grown  in  a  medium  known  as  LB  (Luria  Broth  or   Luria-­‐Bertani  broth).    Other  factors  that  are  important  for  growth  are  oxygen  (for   complete  respiration  to  occur)  and  temperature.    The  culture  can  be  oxygenated  by   rapid  shaking  in  an  incubator,  and  for  E.  coli,  the  optimal  growth  temperature  is   37°C.    Under  these  conditions  E.  coli  can  reproduce  in  about  20  minutes.       We  will  grow  E.  coli  in  both  liquid  cultures  and  on  solid  medium.    The  solid  medium   differs  from  the  liquid  only  in  that  agar  is  added.    Following  sterilization,  the  agar   cools  and  forms  a  solid  (much  like  Jello  gelatin  that  you  may  have  made  at  home).           Sterilization  and  the  Use  of  Antibiotics:   Sterilization  of  the  media,  you  will  see,  is  very  important.    Sterile  media  and   reagents  permit  you  to  culture  bacteria  of  your  choice  without  contamination  by   other  microorganisms.  Bacterial  strains  must  be  appropriately  labeled,  and  that   they  must  be  properly  stored  and  archived  both  in  research  labs  and  in  teaching   labs.    Sterilization  is  most  often  carried  out  by  placing  the  media  in  an  autoclave.     The  autoclave  is  a  close  relative  to  the  pressure  cooker  that  some  households   employ.    It  is  a  device  that  operates  at  high  temperatures  (around  121°C)  and  at   relatively  high  pressures  (around  15  lbs/in ).    Treatment  of  the  media,  reagents,  or   laboratory  apparatus  for  20  minutes  under  these  conditions  will  kill  all   microorganisms,  and  render  the  materials  sterile  and  ready  for  experiments.    You   will  see  the  autoclave  in  action,  and  shortly  after  the  media  comes  out,  you  will   handle  it.    It  is  thus  important  to  remember  that  it  is  in  fact  hotter  than  boiling   1 water,  and  infrequently,  superheated  bottles  explode  when  bumped.    For  this  reason   it  is  necessary  to  keep  all  screw  caps  loose  during  autoclaving,  and  to  handle  all  hot   materials  with  extreme  caution.    Let  the  materials  sit  for  a  short  time  to  cool  before   handling  them.       In  many  cases,  bacteria  are  grown  in  the  presence  of  antibiotics.    These  compounds   are  numerous,  and  they  work  in  basically  two  different  ways.    Some  antibiotics  are   bacteriostatic,  meaning  that  they  do  not  kill  the  organism,  but  simply  make  it   incapable  of  reproduction  (in  bacteria  growth  equals  cell  division).    Other  types  of   antibiotics  are  called  bacteriocidal  and  they  kill  the  bacteria.       The   direct   effects   of   antibiotics   have   been   observed   as   early   as   in   ancient   civilizations;   however,   the   people   of   ancient   Egypt   or   China   did   not   know   the   antibacterial  properties  of  molds  and  how  they  were  used  to  treat  diseases.  In  the   late  1800s  the  search  for  anitbiotics  had  begun,  and  by  1890  two  German  doctors   became  successful  in  extracting  antibiotics  from  microbes,  making  pyocyanase,  the   first  antibiotic  used  in  hospitals.  In  1928  the  antibacterial  properties  of  the  mold   Penicillium  notatum  were  dis covered,  and  by  1942  Penicillin  was  sold  as  a  drug  for   the  treatment  of  syphilis  and  Staphyloccus  infections.     Antibiotics   today   are   very   commonly   used   for   treatment   of   diseases   of   a   wide   variety   of   species.   The   development   of   new   antibiotics   is   becoming   increasingly   faster,  as  science  is  said  to  be  in  an  “evolutionary  arms  race”  with  bacteria  and   viruses  that  are  responsible  for  causing  a  variety  of  infectious  diseases,  which  kill   millions  of  people  annually.     Most  bacteriocidal  antibiotics  inhibit  cell  wall  synthesis.  Ampicillin,  a  derivative  of   penicillin s ceocd . h nboc neees h he ynhes h   peptidoglycan   layer   between   the   inner   and   outer   membranes.     It   kills   cells   attempting  to  divide  or  cells  laying  down  a  new  peptidoglycan  layer .  The  plasmids   that  we  will  use  confer  resistance  to  ampicillin  (similar  in  structure  to  penicillin)  by   virtue  of  the  fact  that  they  contain  a  bacterial β-­‐lactamase  gene.    The  β-­‐lactamase   cleaves   the   ampicillin   molecule   such   that   it   can   no   longer   affect   peptidoglycan   synthesis,   and   therefore   the   cell   can   make   a   cell   wall   and   will   reproduce.   Streptomycin  is  another  bacteriocidal  antibiotic,  commonly  used  in  the  treatment  of   large  animals  (cattle,  horses  etc.)  against  gram  negative  bacteria.  It  binds  to  the  30s   subunit   of   the   ribosome,   preventing   formyl-­‐methionyl-­‐tRNA   from   binding   to   the   ribosome,  therefore  preventing  the  initiation  of  protein  synthesis.  Tetracycline  is  an   example   of   a   bacteriostatic   antibiotic,   which   you   may   have   taken   for   bacterial   infections.  This  antibiotic  binds  to  the  30S  subunit  of  the  bacterial  ribosome  and   interferes  with  the  binding  of  aminoacyl  tRNAs  to  the  A  site,  inhibiting  translation.   Consequently,  the  cells  cannot  make  new  proteins.       When  you  make  your  medium,  some  of  it  needs  to  be  supplemented  with  an   antibiotic.    However,  autoclaving  the  antibiotics  will  destroy  the  activity  of  the  drug,   so  they  must  be  added  after  autoclaving  and  after  the  medium  has  cooled  to  <60°C.       2 The  stock  solution  of  ampicillin  has  been  filter  sterilized  (to  avoid  contamination)   and  is  made  as  a  1000X  stock.  The  second  experiment  will  require  you  to  make  LB   plates,  and  you  will  inoculate  them  in  several  ways.         Goals  for  the  Microbiology  Module:   1. to  learn  how  to  make  simple  microbiological  media.   2. to  grow  bacteria  on  plates  in  order  to  pick  single  colonies.   3. to  grow  bacteria  in  liquid  culture  and  determine  growth  rate.   4. to  determine  the  relationship  between  the  optical  density  of  the  culture  and  the   concentration  of  bacteria.   5. to  practice  performing  dilutions  and  the  mathematics  involved  in  determining   the  concentration  of  bacteria.   This  module  consists  of  three  lab  periods:   Lab  2B:  Preparation  of  liquid  medium  and  plates   Lab  3A:  Growth  and  enumeration  of  bacteria   Lab  3B:  Analysis  of  bacterial  growth  data  (&  preparation  of  plates  for  molecular   biology  module)     Practical  Aspects  of  making  Bacterial  Media:   LB  is  one  of  the  simplest  types  of  media  to  make,  in  part  because  it  can  be  purchased   as  a  premixed  powder.  LB  consists  of  three  basic  ingredients:  tryptone  (a  mixture  of   partially  hydrolyzed  proteins),  yeast  extract  (as  the  name  implies,  an  extract  from   yeast  cells),  and  sodium  chloride.  The  LB  mix  that  you  will  use  only  requires  that   you:   a. know  the  final  volume  of  medium  that  you  wish  to  make.   b. weigh  out  the  appropriate  amount  of  solid  powder.   c. measure  the  correct  amount  of  deionized  water  and  mix  it  with  the                       powder.     If  you  are  to  make  solid  medium  (plates),  you  need  to  add  the  proper  amount  of  agar   to  the  LB  liquid.    To  do  this,  you  only  need  to:   a. know  the  final  volume  of  the  medium.   b. calculate  what  1.5%  (w/v)  of  this  should  be.   c. weigh  out  the  appropriate  amount  of  agar  and  add  it  to  the  LB,  but  add   agar  only  to  the  vessel  in  which  you  will  be  autoclaving  the  media.     Be  aware  that  while  the  LB  powder  will  quickly  go  into  solution  (within  several   minutes),  the  agar  will  not  (remember  that  it  is  something  like  Jello  and  therefore   you  need  to  heat  it).    This  is  simple  and  you  don’t  really  need  to  do  anything  except   pour  the  agar  directly  into  the  liquid  and  then  place  the  flask  in  the  autoclave.    The   autoclave  will  take  care  of  melting  the  agar  for  you.       Example:  Suppose  you  are  asked  to  make  50ml  of  LB  agar.  Check  the  stock  bottle   for  the  number  of  grams  needed  per  liter,  and  divide  this  by  20  (or  multiply  by   3 0.05).    Select  a  flask  that  is  capable  of  holding  at  least  4  times  the  desired  volume  (a   250ml  flask  is  commonly  used).    Use  a  Sharpie™  marker  to  record  your  name,  the   date,  and  the  contents  of  the  bottle  (e.g.,  write  LB  agar).  Add  about  49ml  of   deionized  water  to  the  flask  and  then  add  the  powder.    [Note  that  this  is  not  going  to   yield  exactly  50ml,  but  minor  errors  in  weighing  and  measuring  liquid  volumes  are   also  aspects  that  can  lead  to  the  production  of  solutions  that  are  not  ‘exact’.     However,  for  the  purpose  of  our  lab,  this  method  is  sufficient].    You  can  mix  by   placing  the  flask  on  a  rotating  shaker,  or  use  a  magnetic  stir  bar  and  stirrer.    When   dissolved,  you  need  to  remove  the  stir  bar.    Now  weigh  out  and  add  the  agar.    Place  a   foam  stopper  in  the  top  of  the  flask,  cover  the  top  with  aluminum  foil.    Place  it  on  the   tray  of  materials  to  be  autoclaved.    After  it  is  returned  from  the  autoclave,  place  the   hot  flask  in  the  water  bath  marked  55°C.  Let  it  stand  for  at  least  10  minutes  and  give   it  a  swirl  once  or  twice  during  that  time  so  that  the  heat  can  be  transferred.    Now   your  medium  is  at  55°C  (you  should  be  able  to  hold  it  in  your  hand).    While  you  are   waiting,  you  need  to  get  your  petri  dishes  ready  for  pouring.    What  you  need  are  the   appropriate  number  of  dishes  (usually  about  30ml/dish  is  optimal),  and  a  bunsen   burner  at  hand.  When  you  are  ready,  take  the  flask  from  the  water  bath,  swirl  to  mix   (but  not  too  vigorously  as  this  will  introduce  bubbles  into  your  media),  and  flame   the  mouth  of  the  flask.    Now  pour  about  a  small  amount  into  each  of  the  two  plates,   replace  their  covers  and  let  them  sit  until  the  agar  solidifies.    Remember  to  quickly   wash  out  the  flask  so  that  any  residual  agar  won’t  harden  and  make  it  difficult  to   wash,  and  place  the  flask  in  the  dirty  labware  wash  basin.       LAB  2B:  Making  liquid  and  solid  bacteriological  media   Before  you  begin,  there  are  a  few  things  to  be  aware  of.    First,  you  will  need  to  be   familiar  with  how  to  use  the  balance.  Don’t  contaminate  the  stock  bottle  of  LB   powder,  but  use  a  fresh  spatula.    Take  out  only  a  small  amount  of  the  powder  onto   a  piece  of  weigh  paper  or  a  weigh  boat  (remember  to  tare  the  paper  or  boat  first!).     If  more  powder  is  required,  fine.    If  you  have  taken  out  too  much,  throw  it  away.    Do   not  return  it  to  the  stock  bottle.    Be  careful  not  to  spill  the  chemicals  on  the  balance   or  the  benchtop,  and  clean  up  any  spills  immediately.    Place  used  spatulas  in  the   beaker  marked  “dirty  spatulas”.     I. Each  group  of  students  will  make:     • 200ml  of  LB  (see  *  below;  make  2x  50ml  in  bottles,  2  x  50ml  in  250ml  flasks)   • 2  x  [180ml  of  LB  +  1.5%  agar]  in  2x  500ml  flasks.           LB  liquid  medium  *   LB  consists  of  3  basic  ingredients:  tryptone  (a  mixture  of  partially  hydrolyzed   proteins),  yeast  extract  (mushed  up  yeast  cells)  and  sodium  chloride.  This  is  sold   commercially  as  a  premixed  powder  that  can  be  weighed  out  and  dissolved  in  water.   To  make  liquid  LB  media:     1. You  should  know  the  volume  you  need  to  make   2. Weigh  out  the  correct  amount  of  powder  (provided  by  the  manufacturer  on   the  container)   4 3. Measure  out  the  correct  amount  of  DI  water  to  add  to  the  powder.     Solid  medium:   1. Procure  a  500ml  flask.    You  will  also  need  a  graduated  cylinder.   2. Add  150ml  of  DIW  to  the  flask.    Weigh  out  the  appropriate  amount  of  LB/agar   powder  (note  that  this  is  different  from  the  LB  powder  used  for  making  liquid   medium!),  and  carefully  introduce  it  into  the  flask.    Try  not  to  let  it  touch  the   sides  near  the  top  as  the  powder  will  stick  to  the  wet  surface  and  not  be   available  for  the  solution.   3. Use  another  30ml  of  DIW  to  rinse  out  the  weigh  boat  and  add  it  to  the  flask.  Now   you  have  180ml  of  an  LB/agar  suspension.  The  autoclave  will  take  care  of   dissolving  the  agar.     4. Label  your  flask  as  in  the  liquid  medium  instructions.    (Be  sure  you  know  which   is  the  LB  and  which  is  the  LB/agar.)   5. Repeat  to  make  one  more  batch  of  LB  agar.     6. Obtain  12  sterile  Petri  plates  and  label  them  along  the  bottom  edge  with                               ‘LB  ’,  your  group  name  and  date  in  preparation  for  pouring  plates.       Follow  the  procedures  as  outlined  by  your  TA  for  cooling  the  media,  adding   antibiotics,  and  pouring  12  plates.         Here  are  some  general  guidelines:   • When  the  media  is  at  ≈55°C,  take  it  from  the  water  bath  and  wipe  the  water   off  of  it  with  a  paper  towel.       • Set  up  your  lab  bench  such  that  your  Bunsen  burner  is  towards  the  back,   your  sterile  plates  are  on  one  side  and  the  flask  is  on  the  other.       • Briefly  flame  the  mouth  of  the  flask,  then  pour  equal  amounts  of  your  media   into  each  of  the  12  plates.    A  general  guideline  is  to  fill  the  bottom  portion   about  half  full.  (A  little  more  or  less  will  make  no  difference,  but  leave  enough   for  the  last  one).       • Your  TA  may  demonstrate  how  to  pour  the  plates.    Leave  the  plates  on  the   bench  until  the  agar  solidifies,  and  then  place  them  in  your  group’s  storage   cabinet.    Be  sure  to  wash  your  hands  well  before  leaving  the  lab.       Growth  and  Enumeration  of  Bacteria:   There  are  many  strains  of  bacteria,  and  healthy  cultures  of  E.coli  have  a  doubling   time  (or  generation  time:  the  time  required  to  reproduce  to  double  the  number  of   cells)  of  about  20  minutes  in  rich  medium  at  37°C.         The  availability  of  nutrients,  temperature  and  oxygen  are  components,  which   influence  growth  and  reproduction  of  microorganisms.  There  are  many  direct  and   indirect  methods  for  enumerating  bacteria,  and  one  can  use  different  methods  to   make  either  a  total  cell  count  (living  and  dead)  or  the  viable  cell  count  (living  cells   only).    Often  these  methods  are  coupled  together  in  order  to  determine  growth  rate   and  explore  different  parameters  of  growth  and  reproduction.    In  LAB  3A  we  will   5 make  indirect  measurements  of  the  growth  of  cultures  and  correlate  this  data  with   direct  colony  counting  of  diluted  cultures  called  viable  counts  in  LAB  3B.    In  this   way  one  can  construct  a  growth  curve,  which  can  be  used  to  determine  the  viable   cell  count  at  various  growth  times.       This  exercise  will  serve  to  acquaint  you  with  the  use  of  a  spectrophotometer  and   will  reinforce  the  concept  of  making  dilutions  and  calculating  cell  numbers.         Turbidity  (optical  density):   Turbidity  measurements  assess  the  growth  of  cultures.    Turbidity  might  also  be   equated  with  "cloudiness",  and  is  a  measure  of  the  number  of  particles  (bacteria)  in   a  suspension.  Thus,  densely  populated  cultures  will  be  very  turbid  (cloudy)  and  give   high  turbidity  values.    In  the  spectrophotometer,  this  may  be  measured  by  light   transmittance  or  by  absorbance.    One  thing  to  keep  in  mind  is  that  high  values  could   be  due  to  a  very  healthy  culture,  which  is  exponentially  growing,  or  it  may  be  due  to   a  culture,  which  has  been  depleted  of  nutrients  and  may  consist  of  more  dead  cells   than  live  ones.    This  is  illustrated  in  the  graph  below.           The  curve  can  be  broken  up  into  several  parts.    In  the  beginning
More Less

Related notes for BIOB12H3

Log In


Don't have an account?

Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.