Class Notes (838,985)
Canada (511,151)
BIOB12H3 (30)
Lecture

BIOB12H3S-2014-PDF#5(1).pdf

23 Pages
113 Views
Unlock Document

Department
Biological Sciences
Course
BIOB12H3
Professor
Aarti Ashok
Semester
Winter

Description
BIOB12H3S:  Cell  &  Molecular  Biology  Laboratory       Molecular  biology  module  (PDF  #5)     Introduction  and  Terminology   In  the  molecular  biology  module,  we  wish  to  acquaint  you  with  some  of  the  most   basic  (but  some  of  the  most  powerful)  techniques  in  molecular  biology,  and  help  you   to  understand  how  clones  are  generated  and  how  they  can  be  characterized  and   used  to  examine  gene  expression.     To  begin  to  understand  how  powerful  cloning  tools  can  be,  one  must  have  some   background  in  several  areas.  These  concern  recombinant  DNA  techniques,  host  cell   transformation  and  selection  of  recombinant  clones.    We  will  discuss  these  aspects   and  you  will  perform  some  of  them  in  the  lab.  Recombinant  DNA  technology  is  a   battery  of  techniques,  which  continues  to  grow  as  clever  scientists  discover  new   methods.    One  of  the  most  used  techniques  of  molecular  biology  is  the  ability  to   propagate  individual  DNA  molecules.  We  refer  to  this  as  ‘cloning’,  for  in  essence,  a   clone  of  host  cells  is  generated  which  contains  only  one  type  of  recombinant  DNA   molecule.    Here  are  some  terms  that  are  commonly  used  in  molecular  biology   laboratories:     1.  Restriction  enzymes:  Enzymes  isolated  from  prokaryotes  which  recognize  specific   DNA  sequences  and  act  as  endonucleases  to  break  the  phosphodiester  backbone  of   DNA  at  specific  sites.    The  type  II  restriction  enzymes  recognize  palindromic   sequences.    Palindromes  are  regions  of  two  fold  symmetry  and  the  nucleotide   sequence  is  identical  on  both  strands  if  read  from  the  same  direction.    For  example,   the  double  stranded  DNA  below  contains  the  palindrome  AAGCTT.         5’  CCTGTCAGAATTGTAAGCTTCAATGGCGCATATCG3’     3’  GGACAGTCTTAACATTCGAAGTTACCGCGTATAGC5’     2.  Library:  A  collection  of  clones  representing  either  the  entire  genome  of  an   organism  or  the  genes  that  are  expressed  as  mRNA  (see  below)   • cDNA  library:  the  target  DNA  is  generated  by  making  a  DNA  copy  of  mRNA   from  the  organism  (or  tissue  or  developmental  stage)  of  interest.   • genomic  library:  the  target  DNA  is  generated  (usually)  by  restriction  enzyme   digestion  of  genomic  DNA.     3.  Vector:  A  plasmid  or  a  bacteriophage  molecule  that  has  at  least  three  distinct   properties:   • an  origin  of  DNA  replication  such  that  the  vector  can  replicate  autonomously.   • single  restriction  enzyme  sites  for  the  introduction  of  the  target  DNA.   • a  selectable  marker  gene  (usually  one  conferring  antibiotic  resistance).   1 4.  Host:  A  bacterium  (or  sometimes  a  yeast  strain),  which  is  used  to  propagate   individual  DNA  molecules.       5.  Target  or  insert  DNA:  The  foreign  DNA  fragment  inserted  into  a  vector.       6.   Multiple   cloning   site:   A   region   of   a   vector   which   contains   several   unique   restriction  enzyme  recognition  sites  which  may  be  used  to  clone  target  sequences.   When   incubated   with   a   specific   endonuclease,   the   enzyme   will   make   a   double   stranded  cut  at  its  site  in  the  MCS,  resulting  in  a  linear  plasmid.  The  gene  of  interest   is  also  digested  using  the  same  endonuclease.  When  the  gene  and  linear  vector  are   mixed  together,  the  vector  will  reform  a  loop  with  the  gene  of  interest  in  its  MCQ.   Note  that  the  total  size  of  the  vector  will  thus  increase.     7.  Antibiotic-­‐resistance  genes:  A  sequence  of  bases  in  the  plasmid  that  encodes  a   protein  that  makes  the  bacterial  cell  resistance  to  a  select  antibiotic.  The  antibiotic   resistance   gene   is   critical   for   maximizing   the   efficiency   of   DNA   cloning.   When   bacteria  are  transformed  with  the  modified  plasmids,  all  bacteria  will  not  take  up   the  plasmid.  The  bacteria  that  fail  to  do  so  are  of  no  use  to  us  and  should  be  killed  to   maximize   the   growth   of   the   bacteria   that   did   take   up   the   vector.   After   transformation,  the  bacterial  cells  are  exposed  to  this  antibiotic.  Only  the  cells  that   have  taken  up  the  vectors  will  survive,  and  these  can  then  be  cultured  to  clone  our   gene  of  interest.     Some  helpful  reference  material  on  recombinant  DNA  and  cloning:   Look  in  the  Karp  textbook  (used  for  BIO  B10/B11)  at  figures  in  chapter  18.  (the   formation  of  a  recombinant  plasmid  produced  by  ligating  a  restriction  fragment  to  a   plasmid  vector;  the  production  of  a  library  of  human  DNA  fragments  (genomic   library);  colony  filter  hybridization;    a  cDNA  library).       Molecular  biology  module  labs:   In  this  module,  you  will  grow  bacteria  and  then  make  them  competent  to  take  up   foreign  DNA  (4A).    You  will  transf orm  them  with  an  unknown  plasmid  DNA,  and   plate  them  on  selective  medium.    Later,  (4B)  you  will  prepare  plasmid  DNA  from   these  bacteria  and  use  restriction  enzymes  to  generate  a  restriction  map  of  the  clone   (5A).  By  comparing  the  banding  pattern  to  that  of  the  known  restriction  map,  you   should  be  able  to  identify  which  unknown  you  were  given  (5B).       Lab  4A:  Preparation  of  competent  cells,  transformation  with  unknown  plasmid  DNA.     Lab  4B:  Preparation  of  plasmid  DNA  from  cells.   Lab  5A:  Restriction  enzyme  digestion,  gel  electrophoresis  analysis  of  fragments   from  digestion.   Lab  5B:  Analysis  of  data  and  restriction  mapping.     Plasmids  used:  (see  Appendix  1  on  page  22)   pKNAT1         pOpaque  2           pLIM9a   pKNAT3         pM1-­‐9   2 Lab  4A:  Preparation  of  competent  host  cells  for  transformation   E.  coli  is  the  host  cell  used  in  most  molecular  biology  laboratories.    A  substantial   amount  of  what  we  know  about  basic  molecular  processes  is  the  result  of  research   on  E.  coli.    Plasmids  and  bacteriophages,  which  infect  E.  coli  have  been  studied  for   over  60  years,  and  within  the  past  25  years  a  variety  of  different  methods  have  been   employed  to  make  bacteria  competent  (capable  of  taking  up  DNA).    One  of  the   simplest  techniques  centres  on  the  use  of  CaCl .   2  The  calcium  ions  are  thought  to   serve  two  purposes.    First,  they  interact  with  the  negatively  charged  phosphates  in   the  phospholipid  molecules  of  the  E.  coli  cell  membrane.    At  low  temperature,  this   creates  a  relatively  rigid  membrane  structure  that  has  the  propensity  to  form   minute  pores  where  the  positive  charges  of  the  calcium  shield  the  negative  charges   of  the  phospholipids.    Since  DNA  also  has  a  phosphate  backbone,  it  interacts  with   the  CaCl 2  and  forms  a  complex  that  precipitates  onto  the  cells.  This  is  the  second   role  that  calcium  plays.    After  a  short  time,  a  heat  shock  is  given  which  is  thought  to   generate  transient  holes  in  the  membrane  and  permit  the  plasmid  DNA  to  ‘rush  in’.     Now  the  plasmid  is  inside  the  cell.    If  the  plasmid  confers  some  new  and   advantageous  property  to  the  bacterium,  these  cells  may  then  be  able  to  grow  under   conditions  that  would  not  ordinarily  allow  for  growth.     In  the  classical  procedure,  bacteria  are  grown  to  mid  log  phase,  harvested,  and   resuspended  in  a  small  amount  of  sterile,  ice-­‐cold  50mM  CaCl .   2They  are  left  on  ice   for  about  20  minutes,  harvested,  and  resuspended  in  fresh  CaCl .  The 2cells  are  then   left  overnight  in  the  refrigerator  to  ‘season’,  which  generally  increases   transformation  efficiency  by  5  to  10  fold.    Such  high  efficiency  competent  cells  are   necessary  when  there  is  only  a  small  amount  of  DNA  available  or  one  wants  to   obtain  as  many  clones  as  possible  (for  example  in  constructing  a  library).  Under   optimal  conditions  such  cells  may  give  rise  to  over  10  transformants  per   microgram  of  supercoiled  DNA.       In  most  labs,  libraries  are  carefully  generated,  and  eventually  useful  clones  are   selected  from  the  library.    Consider  a  genomic  library  in  bacteriophage  lambda  ( λ ).     The  genomic  clone  selected  may  contain  as  much  as  23kbp  of  insert  DNA,  yet  very   little  of  this  may  be  relevant  to  the  ultimate  goal  (for  example,  one  might  want  the   promoter  of  a  gene  which  could  account  for  only  about  1kbp  of  the  total).    Thus,  it  is   of  interest  to  take  the  longλ  clone  and  make  smaller  subclones  from  it.    For  this   purpose,  there  is  generally  a  lot  of  DNA  available,  and  its  complexity  is  low  (that  is,   there  are  many  copies  of  a  small  number  of  different  fragments  present).    In   practice,  this  means  that  the  transformation  efficiency  does  not  need  to  be  high  for   typical  subcloning  purposes.    There  is  a  simple  procedure  that  can  be  carried  out  in   less  than  an  hour  beginning  with  a  bacterial  stock  on  a  solid  medium.    In  the  lab,  you   will  prepare  competent  E.  coli  by  this  method,  and  transform  with  one  of  the   plasmids  diagrammed  in  Appendix  1.  You  will  then  need  to  identify  which  plasmid   your  group  was  given  after  molecular  analyses.         3 Transformation  of  E.  coli  with  plasmid  DNA   This  experiment  must  be  performed  under  sterile  conditions.    Use  sterile  tubes,   pipette  tips  and  solutions,  and  wear  gloves  when  handling  the  tubes.     Each  pair  will  need:         Other  reagents  &  equipment   XL-­‐1  blue  culture           Inoculating  loop   sterile  10mM  Tris,  50mM  CaCl  solution     2 Bunsen  burner   50ng/ul  solution  of  plasmid  unknown     P1000,  P20  micropipettors   LB  broth             sterile  pipette  tips  (200/1000ul)   2  LB  plates             ice  bucket  with  crushed  ice   2  LB  +  Ampicillin  plates         sterile  1.5  ml  (Epi)  tubes                   Epi  tube  rack                       beaker  with  95%  ethanol                 cell  spreader                 Sharpie  marker                 37°C  and  42°C  water  bath   Procedure:   1. Wearing  gloves,  take  2  sterile  Epi  tubes  from  the  stock  beaker,  close  them  and   label  them  on  the  top:   * “+”  =experimental,  contains  plasmid  DNA,  or     * “-­“    =control,  does  not  contain  plasmid  DNA   2. Using  sterile  technique  and  a  sterile  1ml  blue  tip,  take  1ml  of  bacteria  from  the   XL-­‐1  blue  culture  and  place  in  each  of  the  two  sterile  Epi  tubes.    Spin  in  a   microfuge  for  30  seconds  to  pellet  the  bacteria.    Take  off  the  supernatant  with  a   Pasteur  pipette.    Turn  tube  upside  down  on  a  KimWipe  and  tap  to  remove  all   liquid.    Immediately  return  tube  to  ice  bucket.   3. Use  another  sterile  pipette  tip  and  add  250µl  of  the  sterile,  cold  CaCl  solution   2 into  the  tube  marked  “+”.     * Keep  the  tube  cold.    You  might  try  leaving  the  tube  in  the  ice  (if  it  is   packed  ice  and  the  tube  won’t  sink  into  it).     * Gently  mix  the  bacteria  by  pipetting  with  a  P1000  to  obtain  a   homogeneous  suspension.   4. Repeat  step  3  for  the  tube  marked  “-­“.    Now  you  have  an  experimental  and  a   control  sample  ready.   5. Using  a  P20  and  a  sterile  tip,  take  10µl  of  the  unknown  plasmid  DNA  and   introduce  it  directly  into  the  cell  suspension  in  the  tube  marked  “+”.      Mix  gently   by  tapping  lightly  with  your  finger.     6. Leave  the  samples  on  ice  for  15  minutes.   7. While  the  samples  are  incubating,  use  a  Sharpie  marker  to  write  your  name  on   each  of  the  plates.    For  each  of  the  LB  plates,  write  “+”  or  “-­‐“  (one  of  each)  and  for   each  of  the  LB  +  ampicillin  plates,  write  “+”  or  “-­‐“  (one  of  each).    You  will  plate   equal  amounts  of  each  sample  on  each  of  the  two  types  of  plates.  (Total  number   of  plates  =  4).   8. Now  for  the  heat  shock.    It  is  imperative  that  the  cells  are  shocked.    Take  your  ice   bucket  to  the  42°C  water  bath,  and  plunge  the  tube  into  the  water  such  that  the   cell  suspension  is  covered.    Do  not  shake  or  tap  the  tube,  just  hold  it  in  place  for   4 90  seconds  (and  no  longer!).    Return  the  tube  to  the  ice  bucket  for  one  minute   and  do  not  shake  or  tap  the  tube.     9. Using  a  sterile  tip,  add  250µl  of  LB  to  each  tube.    Place  in  the  37°C  water  bath  for   30  minutes.   10.Collect  your  samples,  and  spread  100µl  of  each  onto  the  appropriate  plates  (LB   or  LB  +  ampicillin  which  are  marked  +  or  -­‐).     11.Take  your  plates  to  the  37°C  incubator  and  stack  them  upside  down.  Why  is  it   important  to  do  this?  (record  your  answer  in  your  notebook).     12.Clean  up  your  lab  bench  and  dispose  of  materials  properly.       **Proper  disposal:  All  materials  which  have  bacteria  in/on  them  (pipette  tips,  paper   towels,  etc.)  are  to  be  placed  in  a  AUTOCLAVE  bag  to  be  sterilized.   The  technician  will  take  the  plates  out  of  the  incubator  tomorrow  and  start  liquid   cultures  from  an  isolated  colony.    In  the  next  lab  period,  your  group  will  receive  a   liquid  culture  of  bacteria  harboring  the  unknown  plasmid.      For  lab  4B  of  this   module,  you  will  harvest  the  bacteria  and  purify  plasmid  DNA  from  them.         Plasmid  DNA  conformations       The  result  of  SSB  and  DSB  on  supercoiled  DNA.  This  forms  the  basis  of  analyzing  DNA  fragments  with  SDS-­‐ PAGE.  Adapted  from  http://www.biochemsoctrans.org/bst/037/0893/bst0370893f01.htm     Plasmids  are  typically  small  molecules,  usually  not  more  than  10kbp  in  length.     Replication  in  most  E.  coli  strains  generates  molecules  that  are  supercoiled.     Supercoiling  refers  to  the  topology  of  the  molecule,  and  is  described  by  a  solenoid  or   coiled  coil.    This  superhelical  tension  gives  the  molecule  a  smaller  surface  area  than   a  circular,  non-­‐supercoiled  or  linear  molecule.    Superhelical  tension  can  be   illustrated  by  taking  a  rubber  band  and,  while  holding  one  end  immobile,  twisting   the  other  end  around.  The  rubber  band  quickly  adopts  a  supercoil,  which  makes  it   shorter.    More  twisting  of  the  free  end  will  produce  additional  supercoils  and  the   rubber  band  will  assume  a  very  compact  conformation.  Plasmids  are  found  in  E.  coli   as  supercoiled  molecules,  but  during  the  purification  process,  nicking  can  occur.     Nicking  can  occur  by  physical  forces  or  can  be  due  to  the  action  of  nucleases   (endonuclease  activity),  with  the  result  being  the  relaxation  of  superhelical  density   5 (for  one  end  of  the  double  helix  is  now  free  to  rotate)  and  the  formation  of  open   circular  DNA.       Formation  of  an  open  circle  due  to  a  SSB         -         Open circle:   Has greatest   surface area and is least     flexible.   Supercoiled:  Is  very   Linear: can compact  and  rapidly   easily pass moves  through  the   through gel matrix but may gel  matrix     become   tangled.         +     The  3  forms  of  DNA  travel  different  distances  during  gel  electrophoresis       Another  form  of  DNA  that  you  will  encounter  in  this  laboratory  is  linear  DNA.  A   double  stranded  break  will  generate  linear  DNA  from  either  supercoiled  or  open   circular  forms,  and  is  often  generated  by  restriction  enzyme  digestion  (where  the   restriction  enzyme  cuts  the  target  DNA  only  once).    If  there  are  two  sites  in  the   target  molecule,  linear  DNA  is  generated,  but  it  is  in  the  form  of  two  (linear)   fragments.    If  these  three  forms  are  available  you  can  see  the  effect  of  the   conformation  on  the  migration  of  the  molecules  in  gel  electrophoresis.    Keep  in   6 mind  that  these  different  forms  are  all  the  same  size,  but  their  conformation  dictates   how  effectively  they  can  move  through  a  gel  matrix.  After  you  have  purified  your   unknown  plasmid  DNA,  you  will  subject  it  to  restriction  enzyme  digestion  and  will   run  the  products  of  digestion  on  a  gel.    Cleavage  with  a  restriction  enzyme  (once  or   multiple  times)  will  render  all  fragments  linear  and  the  migration  of  these   fragments  through  the  gel  can  be  directly  compared  to  linear  size  standards  (usually   purchased  commercially,  but  can  be  made  in  the  lab  if  you  know  the  nucleotide   sequence  of  an  appropriate  molecule).       Plasmid  DNA  purification          cells  are  harvested  and  re-­‐suspended  in  Solution  1,  which  contains  a  buffer  (Tris)  to    ilize  the  pH.    This  buffer  also  contains  EDTA,  which  chelates  cations.  The  effect  of  this  is      deprive  endogenous  (or  exogenously  introduced)  nucleases  of  the  cations  they  require   for  activity  and  thus  prevent  the  degradation  of  the  plasmid  DNA.   Glucose  is  present  to  stabilize  the  osmotic  environment  of  the  cells  and  prevent  premature   lysis.                 Solution  2  is  then  added.    It  is  a  strongly  basic  solution  (0.2  N  NaOH)  and  so  denatures   macromolecules  and  disrupts  hydrogen  bonding  between  the  DNA  strands.    It  also  contains   SDS,  a  detergent,  which  also  denatures  proteins  and  solubilizes  lipids.    The  effect  of  these   two  reagents  is  to  lyse  the  cell  and  denature  nucleic  acids  and  proteins.               Solution  3  is  a  concentrated  potassium  acetate  salt  solution  at  low  pH.    Upon  addition,  this   has  a  two-­‐fold  effect.    First,  the  low  pH  neutralizes  the  basic  pH  introduced  by  Solution  2.     Second,  the  potassium  salt  forms  a  complex  with  SDS  and  the  molecules  to  which  it  is      d.    This  results  in  a  precipitate  containing  most  of  the  membranes  and  chromosomal      of  the  cell.    The  plasmid  DNA,  in  part  due  to  the  fact  that  it  is  supercoiled,  can  rapidly   renature  and  it  remains  soluble.           Centrifugation  removes  most  of  the  precipitate.    Finally,  the  addition  of  ethanol  dehydrates    e  plasmid  DNA,  and  it  can  be  collected  as  a  precipitate,  washed  with  70%  ethanol  to    move  excess  salt,  and  resuspended  in  an  aqueous  buffer  for  further  analysis.       7 Lab  4B:  Purification  of  Plasmid  DNA   In  this  lab  you  will  purify  plasmid  DNA  from  bacteria.    A  few  words  of  caution  first:     1.  Remember  to  dispose  of  bacteriological  waste  properly,  by  putting  it  in  the   BIOHAZARD  bag.    An  EXCEPTION  are  glass  Pasteur  pipettes-­‐these  go  in  a  special   ‘sharps’  container  that  is  separately  autoclaved-­‐your  TA  will  advise  you.   2.  You  haven’t  yet  used  the  microcentrifuge.    Your  TA  will  talk  to  you  about  it,  but   there  are  two  rules:  be  sure  the  caps  of  your  tubes  are  on  securely,  and  be  sure  that   the  rotor  is  balanced  (i.e.  there  is  equal  weight  distribution.  An  Epi  tube  with  the   appropriate  amount  of  water  is  a  good  balance  tube).     Reagents  Needed   Solution  1:  50mM  Tris  pH8.0,  10mM  EDTA,  50mM  glucose   Solution  2:  1%  SDS,  0.2N  NaOH   Solution  3:  5M  potassium  acetate/acetic  acid   70%  and  95%  ethanol   1X  TE  (10mM  Tris  pH7.5,  1mm  EDTA)   E.  coli  culture  harboring  unknown  plasmid     Supplies  and  Apparatus  Needed   1.5ml  microfuge  (Epi)  tubes       Sharpie  marker     Microfuge     Micropipettors         Epi  tube  rack         Ice  bucket   Pasteur  pipettes         Disposable  gloves       Vortex   Waste  beaker           Ice     Procedure:   1. You  will  work  in  2  groups  per  bench.     2. Position  a  waste  beaker,  and  place  two  paper  towels  on  your  bench  surface.   Using  the  Sharpie  marker,  label  the  tops  of  3  Epi  tubes  with  some  label  that   identifies  you.     3. Put  on  a  pair  of  disposable  gloves  and  wear  them  throughout  the  experiment.   4. Take  out  approximately  1ml  of  your  bacterial  culture  with  a  pasteur  pipette  and   dispense  into  the  first  labelled  Epi  tube.     5. Close  the  cap  and  place  in  a  microfuge.    Be  sure  that  your  partner  has  his/her   tube  in  a  position  to  balance  the  rotor.    Spin  for  30  seconds.     6. Take  the  tube  out  of  the  rotor,  open  the  cap  and  pour  the  medium  (the   supernatant)  into  the  waste  beaker.    Tap  the  tube  on  the  paper  towels  several   times  to  dislodge  the  last  drops.       7. Place  the  tube  in  the  ice  bucket  with  the  cap  open.    You  should  have  a  small   brownish  pellet.    Note:  it  is  essential  that  you  keep  the  sample  cold  during  the   next  several  steps.    There  are  times  when  you  need  to  take  it  out  of  the  ice   bucket,  but  do  your  manipulations  quickly  and  return  the  sample  to  the  ice  to   chill.   8. Using  a  micropipettor  set  for  100µl,  take  out  100µl  of  Solution  1  and  add  it  to  the   tube.    Close  the  cap.    Vortex  the  tube  vigorously  for  5  seconds  and  return  to  ice.   Try  to  position  the  tube  at  a  45°  angle  to  the  vortexer  cup  to  get  the  best  mixing   8 action.  This  will  likely  not  dislodge  all  the  bacteria,  but  remember  it  is  important   to  keep  them  cold.    Hold  it  tightly  near  the  top  (so  your  hand  doesn’t  transfer   heat  to  the  sample).    Repeat  the  vortex  step  until  the  suspension  is  uniform.   9. Now  add  200µl  of  Solution  2.    Mix  by  gentle  inversion  (DO  NOT  VORTEX!!!).    You   should  see  the  solution  clear.    Return  it  to  ice  and  wait  5  minutes.   10.Add  150µl  of  Solution  3,  recap  the  tube.    Now  vortex  vigorously  for  10  seconds.   You  should  see  lots  of  white  stringy  material.    Return  to  the  ice  for  5  minutes.   11.Working  quickly,  wipe  the  outside  of  the  tube  with  a  KimWipe™,  and  place  it  in   the  microfuge.  Be  sure  the  rotor  is  balanced.    Spin  for  3  minutes.    During  this   time  open  the  second  of  your  Epi  tubes  and  get  your  micropipettor  (P1000)  or  a   pasteur  pipette  ready  to  transfer  the  supernatant  to  the  new  tube.     12.The  sample  will  have  a  large  pellet  along  one  of  the  walls  of  the  tube  and  some  of   the  precipitated  material  may  be  floating  on  the  top  of  the  sample.    Avoid  this   precipitate  and  draw  off  the  clear  liquid  into  the  second  Epi  tube.     13. Estimate  the  volume  (it  should  be  about  0.5ml).    Using  a  P1000  micropipette,   add  approximately  2  volumes  (1ml)  of  95%  ethanol  (liquid  should  come  up  to   the  1.5ml  mark).    Vortex  10  seconds.      Let  sit  on  the  bench  for  10  minutes.   14.Place  the  tube  in  the  microfuge  and  balance  it.    Spin  for  3  minutes.    As  in  step  5,   pour  the  supernatant  into  the  waste  beaker  and  tap  the  tube  on  the  paper  towel.   15.Using  a  new  pasteur  pipette,  add  approximately  1ml  of  70%  ethanol.    Vortex  for   10  seconds  and  spin  for  3  minutes.    Quickly  decant  the  supernatant  and  tap  tube   on  the  paper  towels.      Let  the  DNA  pellet  dry.    Note:  this  is  important!   16.When  the  pellet  is  dry,  resuspend  it  in  25µl  of  1XTE.  Label  the  tube  side  with   your  name  and  the  date  and  “ML”  (minilysate).      Place  it  in  the  refrigerator  in  the   box  marked  for  your  lab  section.   17.Now  there  is  a  mess  to  clean  up.  The  pasteur  pipettes  are  to  be  placed  (not   thrown)  into  the  decontamination  solution.  Carefully  place  any  sharps  and   liquids  in  the  appropriate  waste  bins.  This  leaves  the  rest  of  the  solid  waste  (Epi,   paper  towels,  etc).  Be  sure  there  are  no  sharps  in  it.    Now  take  a  wet  paper  towel   and  wipe  down  the  bench  area  where  you
More Less

Related notes for BIOB12H3

Log In


OR

Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


OR

By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.


Submit