Class Notes (838,542)
Canada (510,933)
Biology (6,826)
Prof (12)
Lecture 9

Lecture 9 – Select Genetic Technologies.docx

7 Pages
96 Views
Unlock Document

Department
Biology
Course
Biology 2581B
Professor
Prof
Semester
Winter

Description
Lecture 9 – Select Genetic Technologies 1953 – discovery of DNA structure Restriction Enzymes – recognizes a specific sequence of bases anywhere within the  genome and then severs two covalent bonds (one in each strand) in the sugar­phosphate  backbone at particular positions within or near that sequence­ recognition sequence. The  fragments generated are restriction fragments and the act of cutting is called digestion. Have: • Specific recognition sequences • Can differ in length • Result in specific cutting patterns Fragments fit back together if they have: • The same type of ends • Matching sequences Blunt Ends­ fragments that are cut straight  through both DNA strands right at the line of symmetry Sticky Ends­ cut is displaced equally in opposite directions from the line of symmetry by  one or more bases to generate fragments with single­stranded ends The ends can base pair with a complementary sequence form the DNA of any organism  cut by the same restriction enzyme. The longer the sequence, the less frequently there will be a cut. Length of recognition sequences: • 4 bp will cut every 4  = 256 bp 6 • 6 bp will cut every 4  = 4096 bp • 8 bp will cut every 4  = 65.5 kb So depending on if you want a specific average fragment length or a specific number of  fragments you will want different enzymes or different length of time for digestion  (complete vs. incomplete). Unless otherwise stated you can assume you want complete digest­ the DNA has been cut  at every one of the recognition sites it contains In incomplete digest if you don’t give the enzyme enough time to make all the cuts you  get partial cuts – this can scramble the fragments Gel Electrophoresis Used to separate many different types of molecules­DNA of one length  from DNA of another, DNA from proteins, or one kind of DNA from  another. A solution of DNA molecules is put into wells at one end of a porous  gel­like matrix (agarose). The gel is then placed in a buffered aqueous solution and an electric  field between bare wires at either end is applied causing the negatively  charged DNA to go towards the positive pole The gel is incubated with fluorescent DNA­binding dye called ethidium  bromide, unbound dye is washed away, and DNA can be visualized under  UV. Small fragments migrate faster than larger ones through the pores of the  gel. So this can determine the size of the fragments. Actual size of restriction fragments observed on gels is determined by  comparison to migration distances of known marker fragments Genomic DNA is hundreds of thousands of fragments – because there are  so many fragments you just get a smear on the gel. Restriction Maps You can use this information to map­ when you get  your banding pattern you can use it to piece  together which band is next to which. None of the fragments is larger than your one  biggest fragment­ most are smaller in the double  digest, that makes sense because there are two  enzymes making cuts NOTE: same size doesn’t necessarily mean same  fragment. Recombinant DNA­ created by cutting and splicing together a vector and inserted  fragment­ DNA from two different organisms Vector – self­replicating DNA molecule that can be used to transfer DNA between host  cells and which presence can be detected We want to keep track of the vector so we integrate the selectable marker Plasmid – extra chromosomal DNA originally found in bacterial species Cut the enzyme  with the same restriction enzyme  used to generate  the fragment of genomic DNA  and mix the  digested vector and genomic DNA  together with a  DNA ligase. The complementary  sticky ends will  base pair. Transformation  into E. coli­ process by which a  cell or organism  takes up a foreign DNA molecule,  changing the  genetic characteristics of that cell. The vector component of the DNA molecule: 1. Provides a receptacle for the DNA fragment of interest 2. Carries a selectable marker 3. Hijacks the cell’s biochemical machinery to amplify the recombinant molecule 4. Provides a means for distinguishing recombinant molecules from vector­only  molecules 5. Can be trimmed away to allow purification of the amplified insert DNA In order to propagate you transform into E. coli. You want to integrate one vector into one  cell. • Salt • Electroporation Selection for Transformed Cells Only cells containing the recombinant plasmid are able to grow and form colonies =  transformed cells. You have an ampicillin resistance as your marker so when you put the  cells on ampicillin only the cells with the  marker/vector will survive. PCR (Polymerase Chain Reaction) Once a sequence is known, or partially known, recover  versions of the same sequence from any source material Primers specificity Primer length: 18­25 nucleotides Template DNA­ the DNA you start with (plasmid DNA, genomic DNA, restriction  fragment, PCR fragment) Target DNA­ the DNA to be amplified A specific genome region is chose and two  oligonucleotides that correspond to the two ends  of the target region are produced. These act as  primers directing the DNA polymerase. The genomic DNA is put in a test tube with along  with the primers, a solution of four  deoxynucleotides, and Taq DNA polymerase. Heat to 94° C for 5 min­ separates DNA Lower to 50­60° C for 30 sec to the primers can  anneal Raise to 72° C for 1­5 minutes so that DNA  polymerase can proceed To start the next round raise to 94° C again but o
More Less

Related notes for Biology 2581B

Log In


OR

Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


OR

By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.


Submit