MCB 52 Notes

76 Pages
Unlock Document

Harvard University
Molecular and Cellular Biology
Molecular and Cellular Biology MCB 52
Tom Torello

MCB 52: READING AND LECTURE NOTES [09.04] L ECTURE  1: THE  STRUCTURE  OF  DNA Goal: To understand elements of DNA stability and information content by applying scientific reasoning  skills to the knowledge you’ve gained from previous courses. Objectives: 1. Explain how the following contribute to the stability of DNA: hydrogen bonding, entropy,  ionic strength, and base composition. 2. Describe how the geometry of the base pairs leads to the major and minor grooves of the  DNA double helix. 3. Explain how and why sequence information is read in the major groove. HOW IMPORTANT IS THE ΔG FROM H­BOND FORMATION FOR THE STABILITY OF DNA? >> The formation of H­bonds between the bases has a favorable ΔG. However, base pairing involves  breaking an equal number of H­bonds between the bases and water. Thus, the ΔG from H­bond formation  is not very important for the stability of DNA. >> Ordered water molecules that satisfy hydrogen bonding on bases of separated polynucleotide strands  have low entropy, which is unfavorable. Releasing water from the bases by joining strands and creating  the double helix results in disordered water molecules, increasing entropy in the system. >> H­bonding is important for specificity in base pairing. For example, if A and C were to be bonded,  water molecules would be unable to be replaced with H­bonding due to unfavorable angles, resulting in  an unstable pair. BASE STACKING  The bases are hydrophobic and are found in the center of the DNA duplex, where their flat  surfaces “stack” on top of each other.   This is advantages because 1) unfavorable contact with water is minimized, 2) favorable π­π  interactions are created, in which electrons are shared between p­orbitals of adjacent base pairs.  Stacking of GC base pairs with their neighbors contributes more to DNA stability than AT base  pair stacking. HOW DO PROTEINS ACCESS SEQUENCE INFORMATION IN DNA?  The major and minor grooves are created by the edges of the stacked base pairs.  The grooves are unequal in width because the bonds linking the bases to the sugars project at an  angle of 120°. If the bonds linking the bases to the sugars projected at an angle of 180°, then the  two grooves would be identical in width. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES HOW DO PROTEINS KNOW WHERE TO BIND IN DNA? >> The answer lies in the grooves, particularly the major groove, where proteins make contact with  functional groups on the edges of the base pairs. The edges of the base pairs are rich in chemical  information. >> There are typically 10­20 interactions between a given DNA binding protein and the DNA, and those  interactions can involve hydrogen bonds, ionic bonds, and hydrophobic interactions. CHAPTERS 1 – 3 (REVIEW), CHAPTER 4 (THE STRUCTURE OF DNA): PP. 77­92 DNA STRUCTURE DNA Is Composed of Polynucleotide Chains The nucleotide consists of phosphate joined to a sugar, known as 2’­deoxyribose, to which a base is  attached. The sugar and the base alone are called a nucleoside. Adding phosphates makes a nucleotide.  Nucleotides are joined to each other in polynucleotide chains through the 3’­OH of 2’­deoxyribose of one  nucleotide and the phosphate attached to the 5’­OH of another nucleotide, forming a phosphodiester  linkage.  Each Base Has its Preferred Tautomeric Form The purines are adenine and guanine, and the pyrimidines are cytosine and guanine. Each of the two  bases exists in two alternative tautomeric states, which are in equilibrium with each other.  The Two Strands of the Double Helix are Would around Each Other in an Antiparallel Orientation The Two Chains of the Double Helix Have Complementary Sequences The Double Helix is Satisfied by Base Pairing and Base Stacking Hydrogen Bonding is Important for the Specificity of Base Pairing Bases Can Flip Out from the Double Helix DNA is Usually a Right­Handed Double Helix The Double Helix has Major and Minor Grooves The Major Groove is Rich in Chemical Information The Double Helix Exists in Multiple Conformations DNA Can Sometimes Form a Left­Handed Helix DNA Strands Can Separate (Denature) and Reassociate MCB 52: READING AND LECTURE NOTES When the temperature of a solution of DNA is raised to near the boiling point of water, the optical density  (called absorbance) at 260 nm markedly increases, a phenomenon known as hyperchromicity. Melting temperature of DNA is a characteristic of each DNA that is largely determine by the G:C content  of the DNA and the ionic strength of the solution. The higher the percent of G:C base pairs in the DNA  (and hence the lower the content of A:T base pairs), the higher is the melting point. Likewise, the higher  the salt concentration of the solution, the greater is the temperature at which the DNA denatures.  MCB 52: READING AND LECTURE NOTES [09.06] L ECTURE  2: X­R AY D IFFRACTION  AND  THE  STRUCTURE  OF  DNA Goal: To understand how X­rays revealed the DNA double helix Objectives: 1. Identify and explain the five main features of Photo 51 and what they tell us about DNA  structure. 2. Predict the diffraction pattern that would result from alterations to DNA structure. 3. Analyze a different diffraction pattern and predict features of the structures that would  generate this pattern. 4. Explain why we need to use x­rays to “see” DNA. WHAT WAS KNOWN IN 1953? WHAT WAS NOT KNOWN?  Known: DNA carried genetic information, chemical composition of DNA, DNA formed large  fibres  Unknown: How was the genetic information organized? How did the chemical structure allow for  faithful replication? THE DNA DOUBLE HELIX  Small repeat (3.4 Å base­pair repeat), 34 Å helical repeat (period)  10 Å helix radius, 10 base pairs per period PHOTO 51  X­pattern >> helix  Helical period >> distance between spot layer lines is 1/P  Radius >> calculated with crossing angle and P  Two molecules (offset) >> missing 4  layer line  Smaller repeat >> density at 10/P RELATIVE SCALE OF LENGTHS WHY USE X­RAYS TO STUDY THE STRUCTURES OF MOLECULES? Anything smaller than visible light requires X­rays to measure OPTICAL IMAGING VS. X­RAY SCATTERING MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  X­rays hit object of interest, scatters, use film to collect, use computer to recreate structure DIFFRACTION FROM ORIENTED FIBERS OF DNA  DNA all aligned along helical axis, not necessarily evenly spaced (not a crystal structure) DIFFRACTION FROM ORIENTED FIBERS OF DNA CONSTRUCTIVE AND DESTRUCTIVE INTERFERENCE X­RAY SCATTERING: CONSTRUCTIVE INTERFERENCE  Scatters at the same angle theta as the X­ray hits the atom  Note that the second wave travels an extra distance compared to first one  >> in­phase waves >> dark spots on the film X­RAY SCATTERING: DESTRUCTIVE INTERFERENCE  With a different distance, no longer an integral number of the wavelength  >> out of phase waves >> light spots OPTICAL SIMULATION OF X­RAY DIFFRACTION BY DNA  The diffraction from a horizontal row of lines produces a vertical a series of spots.  There is a reciprocal relationship between the spacings in real space and spacings in diffraction  space (if real space is smaller, space between dots increases)  If you represent the DNA double helix as two waves, each waves have a “zig” and “zag”  component… so only a helix could produce the X pattern.  Also, since molecules are orthogonal to diffraction pattern, the diffraction pattern will reveal the  crossing angle of the actual molecule.   Helical repeat  (P, period) >> distance between layer lines of spots is 1/P  Knowing helical period and crossing angle, can solve for radius using trigonometry.  Missing 4  layer line out of 10 >> two molecules that are offset (3/8) th  Density increases as you get to the 10  layer line, which is from the smaller base­pair repeat  within the larger helical repeats (remember that diffraction produces reciprocal pattern), dark spot  is from relatively high quantity of base pairs compared to a period CHAPTER 4 (THE STRUCTURE OF DNA): PP. 88­89 MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  Central “Maltese” cross, composed of broad spots (breadth of spots reflecting disorder in  the fiber), with the spots evenly spaced along horizontal “layer” lines.  Counting up and down from the center of the cross, spots at the fourth layer line are  missing.  The Maltese cross and the intensely dark regions at the top and bottom of the image  create a series of four diamond­shaped areas.  Principle underlying X­ray diffraction: when waves pass through a periodic array,  interference occurs between the waves if the wavelength of the waves is similar to the repeat  distance of the array. If oscillations of the waves are aligned, the waves reinforce each other  (“constructive interference”), but if the troughs and peaks are aligned, there is destructive  interference.   A beam of waves passing through a horizontal set of lines should generate a vertical row  of spots. If the horizontal lines are tilted, this produces an array perpendicular to the tilt of the  lines. If waves are passing through sets of tilted lines linked in zigzag fashion, this produces an X  pattern.  Helices are out of register by 3/8ths of a helical repeat, which creates additional  destructive interference cancelling out the fourth layer line.   Pattern of four diamonds will show that periodicity of the double helix is 10 times the  atomic periodicity, from 10 layer lines from the center of the cross to the north and south poles.  Thus, periodicity of the double helix (3.4 nm) is 10 times the atomic periodicity, corresponding to  10 repeating units at a spacing of .34 nm. Because there is one base per sugar­phosphate unit, the  B form of DNA consists of 10 base pairs per helical turn. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES [09.09] L ECTURE  3: METHODS  OF  M OLECULAR  B IOLOGY Goal: Learn how each of the following can be used in the molecular biology lab—PCR, gel  electrophoresis, DNA cloning & endonuclease restriction enzymes, Southern/northern/western blotting For each technique, you should be able to answer the following:  In what situations is this technique used?  What are the key reagents and steps involved?  What information is gained from using this method? AΒ AND ALZHEIMER’S DISEASE  Alzheimer’s disease is characterized by the accumulation of β­amyloid peptide (Aβ) in the brain,  along with a hyperphosphorylated form of another protein called tau  Aβ is derived by sequential cleavage of amyloid precursor protein (APP) by cellular proteases.  The precise physiological function of APP is not understood. APP IS A TRANSMEMBRANE PROTEIN THAT IS CLEAVED BY SECRETASE ENZYMES >> The secretase enzymes can cleave APP at multiple sites. Your goal is to express Aβ42 in cultured  mammalian cells. >> To do this, you plan to: 1) PCR amplify the DNA sequence that codes for this protein, 2) subclone the  PCR product into a plasmid that is suitable for protein expression SETTING UP THE PCR If primers have low G/C content: since G/C stacks more favorably with other base pairs (also 3 H­bonds,  not as important), forms stronger bonds >> lower the annealing temperature If primers have high G/C content: >> raise the annealing temperature, if you lowered, you would get  mismatches that lead to imperfect product Why is it just the annealing temperature that matches? Denaturing temperature is kind of general, all  DNA > single­stranded. Extension temperature is specific to polymerase being used, 72 degrees standard  for Taq polymerase. If product is large (>1 Kb): change the extension time, because more time needed to add dNTPs to create  the product GEL ELECTROPHORESIS 1. Negatively charged DNA molecules migrate to the positive electrode. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES 2. DNA molecules are flexible rods which occupy an “effective volume.” 3. Pores in the gel matrix sieve the DNAs according to their effective volume. Large molecules  penetrate the matrix with more difficulty and therefore move more slowly.  4. DNA can then be visualized using EtBr, which intercalates between the base pairs of the DNA. AGARAOSE VS. POLYACRYLAMIDE >> Agarose has a large pore size – used for large nucleic acids: 10,000 bp to 500 bp >> Polyacrylamide has a small pore size – used for small nucleic acids: 10 bp to 300 bp CDNA SYNTHESIS 1. Isolate cellular mRNAs 2. “reverse transcribe” mRNA into DNA using reverse transcriptase (RT) 3. Remove the RNA 4. Made dsDNA: prime with random hexamers, add dNTPs + DNA polymerase 5. The resulting cDNAs can be amplified by PCR, cloned, etc. RESTRICTION ENDONUCLEASES  Recognize and cleave DNA at specific nucleotide sequences  Most widely known is the restriction enzyme EcoRI from E. coli, which cleaves at the sequence  5’ – GAATTC – 3’  Will cleave any piece of DNA that contains this sequence regardless of the source  Recognizes palindromes, typically 4­8 nt STICKY ENDS  Restriction enzymes can make “blunt” ends or “sticky” ends  Sticky ends can base pair with each other. If we add DNA ligase, they can be covalently joined.  We can join any two DNAs from any organism if they are both cut with the same enzyme to give  compatible sticky ends. WHAT IF PCR PRODUCT DOESN’T CONTAIN RESTRICTION SITES COMPATIBLE WITH  THOSE PRESENT IN THE POLYLINKER?  Include restriction sites on the 5’ ends of the primers. Then, digest the PCR product and vector  with the same restriction enzymes and ligate the digested PCR product into the vector. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  Remember to include start and stop codons!  Select for transformants on medium containing ampicillin. SOUTHERN BLOTS ARE USED TO TEST FOR THE PRESENCE OF SPECIFIC DNA SEQUENCES  Overview: cleave target DNA with restriction enzyme(s), separate on a gel, denature separated  DNA, transfer to a membrane  Incubate the membrane (blot) with a radioactive probe that will bind to its complement.  Expose blot to a piece of X­ray film and a band will appear wherever the probe bound.  Why an alkali solution? Denatures the DNA, makes it single­stranded, makes it single­stranded,  facilitates the probe binding in the next step  Probe: from plasmid itself or a piece of the copied DNA DO THE TRANSFECTED CELLS EXPRESS AΒ PEPTIDE? • Western blot: uses an antibody probe to detect a target protein molecule within a population of  proteins. • Western blotting starts with electrophoresis of denatured proteins (by SDS). • Transfer the separated proteins to a membrane, using electroblotting • Incubate the membrane with antibodies that bind to the protein of interest • Detect where the antibody bound to the blot (use one of several detection techniques), not usually  radioactively labeled CHAPTER 7 (TECHNIQUES OF MOLECULAR BIOLOGY): PP. 147­158 + ONLINE SUPP. NUCLEIC ACIDS: BASIC METHODS MCB 52: READING AND LECTURE NOTES [09.11] LECTURE  4: DNA  TOPOLOGY Goal: To understand how cellular DNA is topologically constrained and explain why that matters for  many DNA “transactions”. Objectives: 1. Explain how the mathematical concept of linking number and two related geometric properties  (twist and writhe) relate to the topology of DNA molecules. 2. Describe the physiological consequences of maintaining DNA in a supercoiled state. 3. Predict how the topology of DNA molecules affects their mobility in an electrophoretic field and  diagram how that was used to experimentally determine the helical periodicity of DNA in  solution. 4. Illustrate how enzymes called “topoisomerases” change the topology of DNA and how drugs that  target topoisomerases are important therapeutic topics. 5. Explain how intercalating agents (such as ethidium bromide) affect the topology of a DNA  molecule.  I. LINKING NUMBER >> Many DNA molecules are topologically constrained, covalently closed circles >> If you try to separate…create knots and tangles Linking number is always an integer. To change Lk, must break at least one ring. Linking number of covalently closed circular DNAs (cccDNAs)  By convention, right­handed DNA has a positive linking number.   The linking number is the number of times one strand passes over the other strand, which is  flattened into the plane.  is the average linking number for a population of DNA molecules. II. TWIST AND WRITHE The topological property of linking number is comprised of two geometric components called “twist” and  “writhe”. Twist: the number of helical turns of one strand about the other. Writhe: when the double helix crosses over itself in three­dimensional space Lk= Tw +Wr MCB 52: READING AND LECTURE NOTES Tw and Wr are interconvertible. Two types of writhe:  Interwound (or plectonemic)  Toroidal (or spiral), such as around a DNA binding protein III. NEGATIVE SUPERCOILING 0 LK : PREFERRED TWIST  Under physiological conditions, B­form DNA has a preferred twist of 10.5 bp/turn  The preferred twist of a DNA molecule N base pairs in length under physiological conditions is:  N/10.5  Ex. 10,000 bp >> Lk must be an integer, so Lk  does not equal Lk SUPERCOILING  Occurs when Lk does not equal preferred twist 0   ΔLk = Lk – Lk  Negative and positive supercoiling SUPERCOILED DNA CAN BE DISTORTED IN TWO WAYS:  Overall shape of the ring may be distorted (writhe)  Helical twist may be distorted  Identical DNA molecules that differ only in their linking number are called topoisomers. IV. GEL ELECTROPHORESIS OF TOPOISOMERS A highly supercoiled cccDNA will have a smaller volume and thus travel faster in a gel, while a circular,  totally relaxed cccDNA will take the longest time to travel through the gel. Note that linear DNA will  travel faster than a circular DNA because it can weave through the pores of the gel more effectively. The fact that DNA topoisomers can be separated from each other by electrophoresis was the basis for the  experiment that showed that DNA has a helical periodicity of 10.5 bp per turn of the helix in solution. SUPERCOILING AND WRITHE  NEGATIVELY supercoiled DNA has: RIGHT­handed interwound writhe & LEFT­handed  toroidal writhe (most organisms have left­handed toroidal writhe around histone proteins >  negatively supercoiled DNA) MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  POSITIVELY supercoiled DNA has: LEFT­handed interwound writhe & RIGHT­handed toroidal  writhe SUPERHELICAL DENSITY  DNA is about 6% underwound *Organisms that live in high­temperature environments, in order to prevent their DNA from denaturing,  will maintain DNA in positive supercoils; DNA is tightly wound together. V. TOPOISOMERASES >> Topoisomerases are essential for DNA replication, untangling DNA during mitosis and many other  DNA “transactions.” >> Topoisomerases are the targets of important medicines. For example, quinolones, such as  ciprofloxacin, are antibiotics that inhibit a special bacterial topoisomerase called DNA gyrase. Other  topoisomerase called DNA gyrase. Other topoisomerase are used in anti­cancer therapy. TYPE I TOPOISOMERASE: DOES NOT REQUIRE DNA, INCREASES LK BY 1  Work by making transient single­stranded breaks in the DNA  No ATP required TYPE II TOPOISOMERASES: CHANGE LK IN STEPS OF 2  Work by making transient double­stranded breaks in the DNA  Requires energy from the hydrolysis of ATP  Can catenate, decatenate and unknot ds circular DNAs DNA GYRASE: A SPECIAL PROKARYOTIC TYPE II TOPOISOMERASE  DNA gyrase introduces negative supercoils into DNA and introduces negative supercoils into  bacterial chromosomal DNA.  Quinolones (such as Ciprofoxacin) are antibiotics that target DNA gyrase TYPE IIA TOPOISOMERASE INHIBITION BY A NEW CLASS OF ANTIBACTERIAL AGENTS  Binds one molecule of topoisomerase  No double­stranded break INTERCALATION OF ETHIDIUM INTO DNA DECREASES THE HELICAL TWIST  Ethidium is a planar molecule that intercalates (“slips in”) between the base pairs of DNA. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  Intercalation of 1 molecule of ehtidium causes the DNA to unwind by 26°, decreasing the twist of  the DNA.  Since ethidium does not break either of the strands of DNA, if ethidium is added to a cccDNA,  that decrease in twist must be accompanied by an increase in writhe.  Thus, adding a small amount of ethidium to a negatively supercoiled cccDNA will cause it to  partially relax.  If you add enough ethidium to a negatively supercoiled cccDNA, it will completely relax.  If you add lots of ethidium, it will become positively supercoiled. CHAPTER 4 (THE STRUCTURE OF DNA): PP. 93­103 MCB 52: READING AND LECTURE NOTES [09.13] LECTURE  5: N UCLEOSOMES  AND  C HROMATIN Goal: To understand how DNA is packaged in the nucleus Objectives:  1. Define the following terms: chromosome, 30­nm fiber, nucleosome, histone. 2. Describe the composition and structure of the nucleosome, including: a. The stoichiometry of the histone core proteins, b. The significance of the positively charged amino acids that make up the histone proteins c. How histone H1 affects the arrangement of nucleosomes on the DNA d. How the DNA wraps around the nucleosome and its significance 3. Explain how nucleases can be used to reveal how nucleosomes interact with DNA DNA IN EUKARYOTIC CHROMOSOMES IS COMPACTED IN CHROMATIN  Chromatin refers to DNA and all the proteins associated with it in chromosomes.  Most of the proteins in chromatin are small proteins called histones, which package DNA into  bead­like structures called nucleosomes.  Nucleosomes are packed into 30 nm fibers, which are assembled into loops on a nuclear scaffold.  NUCLEOSOMES  Nucleosome = protein core and DNA  147 bp of DNA is wrapped ~1.65 times around the core  “Linker DNA” separates adjacent nucleosomes HOW IS DNA WOULD AROUND THE NUCLEOSOME?  Left­handed toroidal  Negative supercoil, allows eukaryotic cells to maintain DNA in negative supercoils INTERPRETING A GEL: NUCLEASE + NUCLEOSOMES  Middle concentration is core + linker, while first lane also shows increments of 150 bp which further  suggests that core + linker = 150 bp.  Lane 1: fragments are 450 bp, 300 bp, 150 bp MCB 52: READING AND LECTURE NOTES Lane 2: every core + linker fragment separated: 150 bp Lane 3: linker DNA completely digested, resulting in 100 bp being the length of the histone DNA NUCLEOSOMES ARE MADE OF HISTONE PROTEINS  Histones are small protein  The proteins are rich in lysine and arginine  Hence they are called “basic” proteins THE NUCLEOSOME CORE IS AN OCTAMER OF HISTONE PROTEINS  Two molecules each of H2A, H2B, H3, and H4  N­terminal tails of the histones protrude from the core and are accessible to modifying enzymes  H1 binds linker DNA HISTONE PROTEINS  Histone­fold DNA = conserved region of alpha­helices SUMMARY OF MAIN POINTS  DNA is wrapped around the nucleosome in a left­handed toroid.  The nucleosome is an octamer composed of two copies each of the histones H2A, H2B, H3, and  H4  Histones have tails that form grooves for wrapping of the DNA strands  Histone H1 compacts nucleosomes into 30­nm fibers.  Chromosomes consist of loops of 30­nm fibers. CHAPTER 8 (GENOME STRUCTURE, CHROMATIN, THE NUCLEOSOME): PP. 220­255 MCB 52: READING AND LECTURE NOTES [09.16] L ECTURE  6: DNA R EPLICATION Goal: To understand how the genetic material is duplicated and assess how duplication is achieved with  extraordinary accuracy. Objectives: 1. Explain how we know that DNA replication is semi­conservative. 2. Explain how the driving force for DNA synthesis is pyrophosphate hydrolysis. 3. Identify the DNA components of the replication fork and predict the necessary features of each  for successful replication. 4. Describe continuous and discontinuous synthesis at the replication fork. 5. Compare and contrast the steps of DNA synthesis, DNA sequencing, and PCR. THE MESELSON­STAHL EXPERIMENT (“THE MOST BEAUTIFUL EXPERIMENT IN BIOLOGY”)  Semiconservative replication (conservative, semiconservative, dispersive)  Grew E. coli in medium containing  N for many generations. Next, shifted bacteria to medium  14 containing  N for various times. Extracted DNA and subjected it to ultracentrifugation in cesium  chloride, separates DNAs of light, heavy, and hybrid densities.  14 1 Generation 2 Generation (only in L,  N) Conservative L, H L, H (more of L) Semi­Conservative I L, I Dispersive I I* (ratio slightly shifted) CHEMISTRY OF DNA SYNTHESIS  DNA is synthesized from 2’­deoxynucleoside triphosphates (dNTPs)  DNA synthesis requires a primer, and more specifically the 3’­OH  The incoming nucleotide is specified by base pairing  Synthesis occurs in a 5’ to 3’ direction with the release of pyrophosphate  The driving force for DNA synthesis is hydrolysis of pyrophosphate SUBSTRATES FOR REPLICATION MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  Base (A, G, C, or T) attached to 1’ of deoxyribose sugar  α­phosphate attached to 5’ of deoxyribose sugar  Primer­template junction  SN2 attack of the 3’­OH to α­phosphate, produces pyrophosphate which is broken down into two  phosphates by pyrophosphatase DNA SYNTHESIS IS AN ENERGETICALLY COUPLED REACTION  Reaction one: NMP )+XTP → (XMP ) +P−P , ΔG = small, modestly favorable  n n+1  Reaction two: P−P→2P i , ΔG = ­7.3 kcal/mol  Combined reaction: ΔG > filter reaction through positively charged membrane (DNA sticks and nucleotides  flow through)  Measure label associated with filter to determine amount of new DNA synthesis  Over time, more radioactivity associated with the filter CENTRIFUGATION METHODS  Equilibrium density gradient centrifugation: separate by density (Meselson­Stahl)  Sedimentation gradient centrifugation: separate by size (Okazaki’s experiment) >> such as using  sucrose inside the tube, large strands will move more successfully HOW DID THIS EXPERIMENT HELP OKAZAKI DEMONSTRATE THE EXISTENCE OF SHORT,  DISCONTINUOUSLY SYNTHESIZED DNA STRANDS?  Okazaki grew E. coli in a medium containing radioactive precursors for a brief period of time  called a “pulse”. He immediately isolated the DNA, denatured it, and determined the sizes by  centrifugation.  On the left, at very short times of labeling (short pulses) very short pieces of DNA are found.  However, with longer times, the pieces of DNA get increasingly longer (120 sec).   He tried the same experiment with a mutant virus that was defective in DNA ligase, so the labeled  pieces of DNA remained short, even after long times of radiolabeling. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES DNA SEQUENCING: TAKING ADVANTAGE OF THE CHEMISTRY IN DNA SYNTHESIS  DNA sequencing requires a primer.  DNA sequencing uses 2’­deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) plus dNTP analogs.  Dideoxy­chain termination method for DNA sequencing CHAPTER 9 (THE REPLICATION OF DNA): PP. 257­276 THE CHEMISTRY OF DNA SYNTHESIS DNA Synthesis Requires Deoxynucleoside Triphosphates and a Primer: Template Junction  The four dNTPs: three phosphoryl groups attached via the 5’­OH of the 2’­deoxyribose  Primer:template junction: template provides the ssDNA that directs the addition of each  complementary deoxynucleotide, primer is complementary to, but shorter than, the template  Template must have exposed 3’­OH adjacent to the single­strand region of the template DNA is Synthesized by Extending the 3’ End of the Primer MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  Phosphodiester bond formed in an S 2Nreaction in which 3’­OH at the end of the primer strand  attacks the α­phosphoryl group of the incoming dNTP. Leaving group for the reaction is  pyrophosphate.  The dNTP that pairs with the template strand is highly favored for addition to the primer strand. Hydrolysis of Pyrophosphate is the Driving Force for DNA Synthesis  Free energy for addition of a nucleotide to a growing polynucleotide change is rather small.  Additional free energy is provided by the rapid hydrolysis of the pyrophosphate into two  phosphate groups by an enzyme known as pyrophosphatase.  Coupled process is a highly favorable reaction with a ΔG of ­7 kcal/mol and an equilibrium  constant of ~10 , DNA synthesis is effectively irreversible. THE MECHANISM OF DNA POLYMERASE DNA Polymerases Use a Single Active Site to Catalyze DNA Synthesis  DNA polymerase uses a single active site to catalyze addition of any of the four dNTPs, through  exploiting nearly identical geometry of the A:T and G:C base pairs.  Does not detect exact nucleotide that enters the active site, instead, monitors whether the  incoming nucleotide can form an A:T or G:C base pair   Only  when a correct base pair is formed are the 3’­OH of the primer and α­phosphate of the  incoming nucleoside triphosphate in the optimum position for catalysis to occur.   Incorrect base pairing leads to dramatically lower rates of nucleotide addition as a result of  catalytically unfavorable alignment of substrates, example of kinetic proofreading  Kinetic proofreading: enzyme favors catalysis using one of several possible substrates by  increasing rate of bond formation only in presence of correct substrate.  DNA polymerases are able to distinguish between rNTPs and dNTPs through steric exclusion of  rNTPs from the DNA polymerase active site. Nucleotide­binding pocket cannot accommodate a  2’­OH on the incoming nucleotide, space is already occupied by two amino acids that make van  der Waals contact with the sugar ring. If these amino acids are changed to ones with smaller side  chains, DNA polymerase is no longer effective at distinguishing between dNTPs and rNTPs. DNA Polymerases Resemble a Hand That Grips the Primer: Template Junction  DNA substrate sits in a large cleft that resembles a partially closed right hand: thumb, fingers,  palm domains  Palm domain: β sheet, contains primary elements of catalytic site, binds two divalent metal ions  (Mg  or Zn ) that later chemical environment around correctly base­paired dNTP and the 3’­OH  MCB 52: READING AND LECTURE NOTES of the primer. Monitors base pairing of most recently added nucleotides, making extensive H­ bond contacts with base pairs in the minor groove, with contacts only forming if recently added  nucleotides are correct. Slowed catalysis and reduced affinity for mismatched DNA >> release of  primer strand and signals for proofreading nuclease to remove the mismatched DNA. ­ 1. One metal ion reduces affinity of 3’­OH for its hydrogen, generating a 3’O primed for  nucleophilic attack of the α­phosphate on the incoming dNTP. 2. Second metal ion coordinates negative charges of the other two phosphates of the dNTP,  stabilizes the pyrophosphate produced by joining primer and incoming nucleotide.  Fingers: residues within fingers bind to incoming dNTP. Once a correct base pair is formed  between dNTP and template, finger domain encloses the dNTP. Stimulates catalysis by moving  incoming nucleotide into close contact with catalytic metal ions. Also associates with the  template region, creating  90  °   turn of the phosphodiester backbone between first and second bases   of the template, which exposes the first template bases after the primer and makes it clear which  template base should pair with the next nucleotide.  Thumb: interacts with DNA that has been most recently synthesized, 1) maintains correct position  of thumb and active site, 2) helps maintain strong association between DNA polymerase and  substrate  Ordered series of events: 1. Incoming nucleotide base­pairs with next available template base 2. Fingers of polymerase enclose base­paired dNTP, placing critical catalytic metal ions in  position to catalyze formation of next phosphodiester bond 3. Attachment of base­paired nucleotide to the primer leads to reopening of the fingers and  movement of primer:template junction by one base pair DNA Polymerases are Processive Enzymes  Processivity: characteristic of enzymes that operate on polymeric substrates.  Degree of processivity: average number of nucleotides added each time the enzyme binds a  primer: template junction  Each DNA polymerase has characteristic processivity ranging from only a few nucleotides to  more than 50,000 bases added per binding event.  Initial binding of polymerase to primer:template junction is rate limiting, ~1 sec, once bound,  adds nucleotides very fast (in millisecond range).  Processivity facilitated by sliding of DNA polymerases along DNA template. Once bound, DNA  polymerase interacts tightly with much of double­stranded portion of DNA, including  electrostatic interactions between phosphate backbone and thumb and interactions between the  MCB 52: READING AND LECTURE NOTES minor groove of the DNA and the palm domain. Sequence­independent nature of these  interactions permits easy movement of the DNA even after it binds to polymerase.   Each time a nucleotide is added to the primer strand, DNA partially releases from the polymerase  (H­bonds with minor groove broken, but electrostatic interactions with thumb maintained.) DNA  then rapidly rebinds to the polymerase in a position that is shifted by 1 bp using the same  sequence­nonspecific mechanism. Exonucleases Proofread Newly Synthesized DNA  One major limit to DNA polymerase accuracy is occasional (1 in 10  times) flickering of bases  into “wrong” tautomeric form. Alternate forms of bases permit incorrect base pairs to be correctly  positioned for catalysis. When the nucleotide returns to “correct” state, incorporated nucleotide is  mismatched and must be removed.   Proofreading exonuclease : degrade DNA starting from 3’ DNA end (exonuclease = only degrade  from DNA end; endonuclease = cut within a DNA strand)  Proofreading occurs without release of DNA from the polymerase. When mismatched base pair  present, primer:template junction destabilized, creating several base pairs of unpaired DNA.  Exonuclease active site has high affinity for single­stranded 3’ ends, so newly unpaired 3’ end  moves to the exonuclease active site. Removal of mismatched base allows primer:template  junction to re­form and rebind the polymerase active site. THE REPLICATION FORK Both Strands of DNA are Synthesized Together at the Replication Fork  Replication fork: junction between newly separated template strands and the unreplicated duplex  DNA  Leading strand: newly synthesized DNA strand, moving towards overall direction of DNA  replication towards the replication fork  Lagging strand: direction of replication is away from the replication fork, strands of DNA  synthesized in discontinuous fashion, formation of Okazaki fragments which are later covalently  joined together The Initiation of a New Strand of DNA Requires an RNA Primer  Primase: specialized RNA polymerase dedicated to making short RNA primers on an ssDNA  template.   Unlike RNA polymerases involved in mRNA, rRNA, and tRNA synthesis, primase does not  require an extended DNA sequence to initate RNA synthesis.   Primase activity dramatically increases when associated with DNA helicase, which unwinds  DNA at the replication fork. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  Requirement for ssDNA template and DNA helicase association ensures that primase is only  active at replication site. RNA Primers Must Be Removed to Complete DNA Replication  To replace RNA primers with DNA, RNase H recognizes and removes most of each RNA primer,  specifically degrades RNA that is base­paired with DNA, removing all of the RNA primer except  the one directly linked to the DNA end, because RNase H can only cleave bonds between two  ribonucleotides.   Final ribonucleotide removed by a 5’ exonuclease.  DNA polymerase can then fill the gap until every nucleotide is base­paired, with the “nick” in the  DNA being repaired by DNA ligase, which uses high­energy cofactors (ATP) to create a  phosphodiester bond.  DNA Helicases Unwind the Double Helix in Advance of the Replication Fork  DNA helicases catalyze separation of the two strands of duplex DNA, bind two and move  directionally along ssDNA using energy of nucleoside triphosphate (usually ATP) binding and  hydrolysis to displace any DNA strand that is annealed to the bound ssDNA.  Typically, DNA helicases that act as replication forks are hexameric proteins that assume the  shape of a ring, complexes encircle one of the two single strands at the replication fork adjacent  to the single­stranded:double­stranded junction.  DNA helicases act processively, unwinding multiple base pairs of DNA each time they bind.  High processivity is due to the ring shape >> release of the helicase from the DNA requires the  opening of the ring (which is a rare event). Alternatively, helicase can dissociate when end of the  DNA strand is reached.  How does helicase bind to DNA in the first place? Obvious problem in circular chromosomes,  same problem in linear because helicase usually loaded onto internal site. >> Specialized  mechanisms that open DNA helicase rings and place it around DNA before re­forming the ring.   Each DNA helicase moves in a defined direction, referred to as polarity of DNA helicase. Can be  a polarity of either 5’ > 3’ or 3’ to 5’, as direction is defined according to the strand of DNA  bound/encircled, rather than the strand that is displaced. So if the helicase is functioning on the  lagging­strand template, the polarity is 5’ > 3’.   Movement along DNA requires input of chemical energy, energy provided by ATP hydrolysis. DNA Helicase Pulls Single­Stranded DNA through a Central Protein Pore Single­Stranded DNA­Binding Proteins Stabilize ssDNA before Replication Topoisomerases Remove Supercoils Produced by DNA Unwinding at the Replication Fork MCB 52: READING AND LECTURE NOTES Replication Fork Enzymes Extend the Range of DNA Polymerase Substrates MCB 52: READING AND LECTURE NOTES [09.18] LECTURE  7: THE  REPLICATION  MACHINE Goal: To understand how the genetic material is duplicated and assess how duplication is achieved with  extraordinary accuracy. Objectives: 1. Explain the roles of the protein components of the replication fork. 2. Predict the effect on replication when one of these components is mutated or removed. 3. Explain the benefits and drawbacks of proofreading activity in a polymerase. 4. Explain why not all polymerases have the same processivity. 5. Explain why lagging strand synthesis needs a DNA primase. THE REPLICATION MACHINE  DNA is synthesized by DNA polymerase: fast, proofreads, processive  Leading strand synthesis requires: DNA helicase, single­stranded DNA binding protein  Lagging strand synthesis requires: DNA primase to produce RNA primers  Leading and lagging strand synthesis are linked: the trombone model DNA POLYMERASE IS FAST  DNA polymerase synthesizes DNA at rate of 800 nt/sec 6  But chromosomes are large: chromosome of E. coli is 4.6 x 10  base pairs  Since there are two replication forks, the overall rate is 1,600 nucleotides per second.  Thus it takes ~40 minutes to replicate the E. coli chromosome. 9  Eukaryotic chromosomes are much larger; the human genome contains 6 x 10  base pairs. Hence,  replication in higher cells initiates at multiple origins. DNA POLYMERASE PROOFREADS ITS OWN WORK  DNA polymerase has a built­in 3’ to 5’ exonuclease that serves as a proofreader for detecting and  removing misincorporated nucleotides.  Clicker question: Given the enzyme and substrates used in DNA replication, why does DNA  synthesis proceed in the 5’ to 3’ direction? The reason is 3’ to 5’ synthesis is: MCB 52: READING AND LECTURE NOTES × 5’ to 3’ synthesis chemically impossible: no, if 3’ to 5’ synthesis, the incoming­OH  can still attack the phosphate groups of the chain. × Unfavorable energy of reaction: actually, energy of the reaction is the same  because there is still formation of pyrophosphate × Interferes with base pairing: no, still occurs as normal ×  Proofreading is the issue ! If DNA synthesis proceeded in a 3’ to 5’ direction and  the nucleotide at the growing end were removed by a “proofreading”  exonuclease, the resulting growing end would be left with  only an   α  ­phosphate   and no pyrophosphate leaving group, DNA synthesis would abort. PROOFREADING IS IMPORTANT FOR REPLICATION  Bases can exist in two tautomeric forms (ex. rare “flickering” of a C into a tautomer)  The rare C tautomer can base pair with A instead of G during replication, leading to  misincorporation of an A.  Tautomerization sets a theoretical limit on the accuracy of nucleotide incorporation. ­4 ­5  At a frequency of about 10  to 10 , adenosine gets incorporated instead of guanine.   Yet the rate of spontaneous mutation is about 10  per round of replication. DNA POLYMERASE IS PROCESSIVE  DNA polymerase binds multiple nucleotides each time it binds.  A sliding clamp tethers DNA polymerase to the DNA template.  A clamp loader loads the sliding clamp on DNA, also able to recognize primer:template junction,  will be able to correctly load where the DNA polymerase needs to be. A PRIMER EXTENSION ASSAY TO MEASURE PROCESSIVITY  Load: DNA polymerase (with a primer), processivity clamp, clamp loader, ATP  With clamp: full synthesis of the template  Without clamp: low concentrations of polymerase, keeps falling off > unreliable synthesis and  production of many short pieces, high concentrations > polymerase can keep attaching and  produce longer stretches  Sliding clamp greatly increases the processivity of DNA polymerase. ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) IS OFTEN USED TO STUDY PROTEIN­ DNA INTERACTIONS MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  Take a labeled DNA, add varying concentrations of protein of interest.  Electrophorese the protein: DNA complexes under non­denaturing (sometimes called “native”)  conditions.  EMSA with sliding clamp: even at high concentrations, small concentrations of DNA­protein  complex detected… because the ring can just slide off linear DNA. HOW TO STUDY SLIDING CLAMP ON DNA?  Use clamp loader + nicked circular DNA + clamp  Add ATP, gel­filtration chromatography (another way to separate by size) × Elution column filled with porous gel beads × Molecules larger than the pores in the beads will come out first, because they  have to travel on the outside of the beads. × Molecules smaller than the pores in the beads will enter the beads, take more  time to come out.  Sliding clamp associated with the DNA is elution­shifted to the left compared with the  free clamp (and in the sample with clamp + DNA, some clamp didn’t associate with  DNA)  If you cut with a restriction enzyme that cuts once, you will get one peak of free clamp. LEADING STRAND SYNTHESIS  The enzyme DNA helicase unwinds duplex DNA downstream of the replication fork in an  ATP­dependent manner.  Single­stranded binding protein (SSB) holds the separated strands apart so that they  don’t reanneal.  DNA polymerase with its sliding clamp continuously elongates the daughter strand.  LAGGING STRAND SYNTHESIS  The enzyme DNA primase generates an RNA primer on the lagging strand.  A molecule of DNA polymerase (also, with a sliding clamp) elongates the primer to  create an Okazaki fragment.  RNase H removes the RNA primer.  DNA polymerase fills in the gap. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  DNA ligase joins the Okazaki fragment to previously synthesized DNA. CHAPTER 9 (THE REPLICATION OF DNA): PP. 277­311 MCB 52: READING AND LECTURE NOTES [09.20] L ECTURE  8: STRUCTURE  AND  MECHANISM  OF  DNA R EPLICATION Goal: To understand how the genetic material is duplicated and assess how duplication is achieved with  extraordinary accuracy. Objectives: 1. Analyze data from and propose experiments to probe the function of the components of the  replication machinery. 2. Predict the effect on replication when a topoisomerase is mutated or deleted. 3. Describe the basic elements for replication initiation and predict the consequence of mutations in  one of the components in replication initiation. 4. Explain the end replication problem and describe the requirement for replicating DNA ends. COMBINING THE CHEMISTRY AND THE POLYMERASE  Role of the O­helix: in the closed conformation, tyrosine interaction with the base, can  perform base stacking to stabilize the catalytic site.   *additional tyrosine located on the end of the O­helix that brings the next base near the  catalytic site (in the closed conformation) and holds the next based to be copied away while in the  open conformation MULTIPLE POLYMERASES INVOLVED IN DNA REPLICATION  Major polymerases: Pol I, Pol III core + Pol III holoenzyme, Pol δ, Pol ε  Pol I: RNA primer removal DNA repair  Pol III core + Pol III holoenzyme: chromosome replication  Pol δ: lagging­strand synthesis; nucleotide and base excision repair  Pol ε: leading­strand synthesis; nucleotide and base excision repair REPLICATION CHANGES THE SUPERCOILING STATE OF THE DNA AND THEREFORE  REQUIRES TOPOISOMERASES  Replication generates positive supercoils ahead of the replication fork  Topoisomerase II required to break the DNA, polymerase can pass DNA through the break >>  negative supercoilings ORIGINS OF REPLICATION  Replication of chromosomes commences at specific sites called origins. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  Initiator proteins bind to specific DNA elements to activate replication.  Replication proceeds bidirectionally from origins with two replication forks that move away  from each other.  Replication of circular chromosomes yields interlocked daughter chromosomes and replication of  linear chromosomes yields tangled chromosomes.  Initiator proteins bind to specific DNA elements to activate replication.  *In circular DNA, topoisomerase II required to cut the two linked daughter molecules  Eukaryotic chromosomes contain multiple origins: initiation is very tightly controlled so that each  origin is activated once and only once per cell cycle. MULTI­FORK REPLICATION  It takes ~40 minutes to replicate the E. coli chromosome. In the lab, E. coli can divide every 20  minutes. How is this possible?  Replicating chromosomes are segregated > segments of chromosome that are replicated twice in a  circle that is otherwise replicated once.  REPLICATING CHROMOSOME ENDS  The lagging strand cannot be completely synthesized because on the end, there is no room for an  additional Okazaki fragment being formed.  Information loss during replication >> cells die  Telomere repeats help protect DNA of essential genes.  Telomerase: builds additional telomeric repeats, which solves the end replication problem. The  telomerase has an RNA component that can pair with the end of the template, creating a primer:  template junction that allows for DNA synthesis. The telomerase then translocates, happening in  successive rounds to keep adding repetitive sequences onto the end of the DNA. CHAPTER 9 (THE REPLICATION OF DNA): PP. 277­311 MCB 52: READING AND LECTURE NOTES [09.23] L ECTURE  9: DNA  DAMAGE , DNA  REPAIR , AND  MUTAGENESIS Goal: to understand how cells repair and tolerate different types of DNA damage Objectives: 1. List the sources of DNA damage and the repair pathway that is associated with each type of  damage. 2. Explain why cells need mismatch repair and describe a mechanism for how the proteins know  which base is correct. 3. Describe, based on the chemistry of the bases, why evolution has selected for T and not U, and  for C and not 5­methyl C in DNA. 4. Compare and contrast DNA repair and DNA damage tolerance. 5. Design experiments to measure survival after DNA damage, test whether or not a chemical is a  mutagen, and quantitate mutagenesis. 6. Predict the phenotype for survival and mutagenesis if a gene is deleted or mutated in a DNA  repair or tolerance pathway. HOW DOES DNA ACQUIRE MUTATIONS? 1. Not all replication errors are caught by proofreading. 2. Chemicals damage DNA. 3. Water damages DNA. (DNA is bathed in 55 molar water!) 4. Ultraviolet light damages DNA. 5. X­rays break DNA. SYSTEMS THAT ENSURE GENETIC INTEGRITY 1. Mismatch Repair corrects replication errors that escape proofreading. 2. Base­Excision Repair mends single damaged bases. 3. Nucleotide Excision Repair mends damage involving more than one base. 4. Double­Strand Break Repair fixes breaks in DNA. 5. Translesion Synthesis bypasses or “tolerates” damage. OCCURRENCE OF MISMATCHES  If a mismatch is not corrected, it can lead to a mutation after the second round of replication. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES BASIC STEPS FOR REPAIR 1. Recognition 2. Excision 3. DNA synthesis 4. Ligation MCB 52: READING AND LECTURE NOTES MISMATCH REPAIR (IN E. COLI)  Mismatch repair catches and repairs mismatches.  Mismatch repair is carried out by three proteins: MutS, MutL and MutH.  MutS scans the chromosome for mismatches; recognizes the mismatch and kinks the DNA.  MutS bound to a mismatch recruits MutL and MutH, which nicks the DNA.  UvrD helicase, an exonuclease, DNA polymerase III, and DNA ligase completes the repair. WHICH STRAND CONTAINS THE CORRECT BASE?  Dam methylase (DNA­adenine methylase) recognizes and methylates the A in 5’–GATC­3’ in E.  coli, but only after a delay.  Delay in methylation leads to the formation of hemimethylated DNA (one DNA strand has  methyl group, one strand does not).  The nick occurs on the unmethylated strand, which is the newly synthesized strand.  Thus, mismatch repair has to occur quickly, right after replication, because once both strands are  replicated, it’s not possible to distinguish between the two strands. EXONUCLEASE DIRECTIONALITY  Nick could happen upstream or downstream.  A different nuclease will be involved in each case (name not important)  Must be able to work at some distance, because a 5’­GATC­3’ isn’t necessarily right next to a  mismatch. HEREDITARY NONPOLYPOSIS COLORECTAL CANCER  Genetic defect in one of the genes encoding the human homologs of MutS or MutL.  Increased number of mismatches increases subsequent number of mutations from those  mismatches that are not repaired.  Mutations in genes controlling growth and division – increased risk of colorectal cancer. CELLULAR DEFENSES AGAINST DNA DAMAGE  Two possible approaches to DNA damage: 1. DNA repair MCB 52: READING AND LECTURE NOTES 2. DNA damage tolerance >> translesion synthesis SOURCES OF DNA DAMAGE  Exogenous: benzopyrene (byproducts of smoking tobacco – intercalates between base pair and  distorts the DNA helix), chemical (alkylation), UV radiation  Endogenous: chemical (alkylation and oxidation), hydrolytic (deamination and depurination) MCB 52: READING AND LECTURE NOTES TYPES OF DNA DAMAGE  Example: oxidation of a G produces 8­oxoG, one of the most stable mutant versions HYDROLYTIC ATTACK  Example: hydrolysis of cytosine > repair proteins recognize uracil in DNA  Repair proteins do not recognize deaminated 5­methyl C in DNA BASE EXCISION REPAIR  Damage generates unnatural bases.  Unnatural bases are recognized and removed by special repair systems known as DNA  glycosylases.  Next, the gap is filled in by DNA polymerase and ligase, restoring the original nucleotide.  1) glycosylase cleaves off the purine, 2) AP endo cleaves to make 3’­OH for Pol I and  exonuclease removes the sugar UV­INDUCED THYMINE DIMERS  Formation of cyclobutane ring > thymine dimer  Changes the structure of the helix  Cisplatin > treatment of cancer NUCEOTIDE EXCISION REPAIR  Nucleotide excision repair is mediated by UvrA, UvrB, and UvrC and other proteins, which: × Scan the DNA for lesions × Unwind the DNA over the lesion × Nick the DNA 12 nucleotides apart on both sides of the lesion × Replace the oligonucleotide with newly synthesized DNA (UvrD removes the  strand of DNA with the lesion) HOW DO WE TEST IF A SPECIFIC GENE/PROTEIN IS INVOLVED IN DNA REPAIR OR   DAMAGE TOLERANCE?  Plate equal number of cells onto each plate.  Expose some plates with cells to UV light. MCB 52: READING AND LECTURE NOTES  Incubate, count, and calculate.  If wild­type: should be able to repair damage, plate exposed to UV will have similar number of  cells growing as plate not exposed to UV  If UV­sensitive mutant: when exposed to UV, only very few cells grow TRANSLESION SYNTHESIS (TLS): MODEL 1, POLYMERASE SWITCHING  Processive DNA replication >> encounters DNA damage  Replication stall and polymerase switching to a translesion polymerase which can synthesize  across the damage (highly error­prone)  Return of the replicative polymerase TRANSLESION SYNTHESIS: MODEL 2, GAP­FILLING TLS  No switching of polymerase, but the replicative polymerase just bypasses the lesion  Gap is filled by translesion polymerases TRANSLESION POLYMERASES  TLS DNA polymerase: more error­prone, lacks proofreading, less processive (do not want them  synthesizing DNA for the rest of the strand)  TLS DNA polymerase lacks the O­helix, creating a large pocket; lacks the level of regulation in  normal polymerase  Can be lesion­specific: one TLS polymerase specific for thymine dimers, different TLS  polymerase better suited for other lesions AMES TEST­ASSAY FOR MUTAGENS  Use Salmonella bacteria culture requiri
More Less

Related notes for Molecular and Cellular Biology MCB 52

Log In


Don't have an account?

Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.