mbb 308 mitderm 1 notes .docx

85 Pages
Unlock Document

Simon Fraser University
Molec Biol & Biochem
MBB 308

Basic Cloning Experiment;  ­Prepare insert for cloning ­Choose a vector ­Make a recombinant DNA ­Put into host cells ­Select desired recombinants ­Isolate recDNA, do your experiments RNAi: newer approaches to study gene expression 1.  generate small RNAs complementary to mRNA (discuss later in the course) 2. the most common application is to inhibit gene expression by causing mRNA degradation The term ‘gene cloning’ is also used, since joining a fragment of DNA with a vector such as a plasmid that  can replicate in bacterial cells enabled the pro­ duction of a bacterial strain (a clone) in which all the cells  contained a copy of this specific piece of DNA Preparing insert DNA for cloning: 1. Restriction enzymes 2. Chemical synthesis 3. Polymerase chain reaction (PCR) 4. Making cDNA from mRNA • Lab01: Orientation and pipetting ­Further discussion of the lab, potential quiz questions etc.    ­See also lecture 1 slides, read your handouts carefully ­find a partner, sign in on the card provided, exchange email and phone #s with him/her ­Don’t forget lab book, lab coat, marker pen etc. Further experiments: Isolate rec DNA, and characterize further: restriction map, DNA seq, express, mutagenesis  in vitro etc. ­Prepare insert for cloning ­Choose a vector ­Make a recombinant DNA ­Put into host cells ­Select desired recombinants ­Isolate recDNA, do your experiments • lecture 2 summary ­This week’s lab: Orientation, pipetting Preparing insert DNA for cloning: 1.  Restriction enzymes  rec DNA, and characterize further: restriction map, DNA seq, express, mutagenesis in vitro etc. ­Some choices for preparing insert DNA for cloning 1. Cut (genomic?) DNA with restriction enzymes 2. Chemical synthesis of DNA 3. Polymerase chain reaction (PCR) 4. Making cDNA from mRNA Generating insert DNA for cloning Restriction enzymes:  bacterial defense mechanism • restriction endonucleases, which break the sugar–phosphate backbone of DNA molecules at precise  sites, and DNA ligases, which are able to join together the fragments of DNA that are generated in this  way  • The reason for this restriction of phage growth is that many bacterial strains produce an endonuclease,  which is therefore known as a restriction endonuclease, that cuts DNA into pieces, so that the incoming  phage DNA is rapidly broken down and only occasionally escapes to produce phage progeny Type I and III –not usually relevant Type II– recognition sites have rotational symmetry (palindromes) and leave different kinds of ends after  cleavage.   Note that DNA strands in a double helix are anti­parallel.  The standard convention is to write a DNA sequence  with the top strand 5’ to 3’, left to right; so the bottom strand is 3’ to 5’, left to right.     a. Cohesive or “sticky” ends     5’ overhang or 3’ overhang  (VERY different consequences vs. 5’) 5’  G/A A T T C  3’                  5’  C T G C A/G 3’ 3’  C T T A A/G  5’                     G/A C G T C $ $ 5’­­­­G            AATTC­­­­3’                                        5’­­­­CTGCA              G­­­­3’    ­­­­CTTAA            G­­­­                                             ­­­­G              ACGTC­­­­ b.  Blunt ends 5’ C C C/G G G      à           ­­­CCC            GGG­­­     G G G/C C C                    ­­­GGG            CCC­­­ Figure 2.8 Bacteriophage restriction • Figure 2.9 Reading a palindromic sequence. The top strand, read from left to right (5¢ to 3¢), is the  same as the bottom strand when also read 5¢ to 3¢ (right to left) • Figure 2.10 Sticky ends generated by EcoRI • Figure 2.11 Restriction fragment ends ­Nomenclature: genus,spp,strain, #  e.g. EcoRI = E. coli, strain R, enzyme #1 • ­Most recognition sites are 4 or 6 bp • Isoschizomers: different enzymes recognize the same sequence • ­Different enzymes can give the same sticky ends • BamHI recognizes 6bp, G/GATCC and leaves  GATC Sau3A recognizes only 4bp /GATC BUT leaves the same GATC.  So you can join DNA cut with this enzyme to  a vector cut with BamHI  (draw this out for yourself?) QUESTION: frequency of cutting with Sau3A versus BamHI? ­more practical information when we do the 308 miniprep lab 3 week 4.   • Figure 2.12 Isoschizomers • Restriction maps ­Restriction maps:  Sample problem on overhead projector • Sample problem done on the overhead in class 2.  CHEMICAL SYNTHESIS  ­Some choices for preparing insert DNA for cloning 1. Cut DNA with restriction enzymes 2. Chemical synthesis of DNA 3. Polymerase chain reaction (PCR) 4. Making cDNA from mRNA Chemical synthesis of DNA Key points:  1. The first (3’) nucleotide in the sequence (Monomer 1) is linked to a glass support by its 3’ hydroxyl.  Its 5’  hydroxyl reacts with the activated 3’ P­of the incoming second nucleotide (Monomer 2)—phosphoramidite  group/method.   2. Organic chem notes:  (i) Attach to solid glass supportà allows efficient purification of product from reactants.   (ii) Blocking groups are critical to ensure that the reaction proceeds only between the desired chemical groups  e.g. the 5’ of monomer 2 is blocked with a DMT group. 10.2.3 Synthetic oligonucleotide arrays • Microarrays, as described above, can equally well be produced with a set of oligonucleotides,  synthesized in the conventional manner and then attached to the glass slide. • The use of photolabile blocking groups prevents the addition of nucleotides to positions where they are  not wanted. The blocking group is destroyed by the action of a laser to activate selected positions. • Initially, after attachment of linker molecules with a protective blocking group, to the substrate, a mask  is positioned over the array, so that the laser will only be allowed to reach the positions where the first  nucleotide is to be attached. Chemical synthesis of DNA (continued) • Repeat with monomer/base 3, 4 etc. • For exam purposes, note TWO other things­­­the structure of the added monomer (can use B,X to  indicate chemical groups), and the direction of chain growth.   • Practical stuff: order online for $1 per nucleotide or less.  Usually make only short oligonucleotides or  “oligos” (16 to 50nt?) for PCR, mutagenesis.  For longer DNA, stitch together several overlapping  oligos.   • Other modified polymers: morpholinos, with 6 member morpholine ring instead of 5C ribose­­­­more  stable in antisense inhibition of gene expression e.g. see www.morpholino.com, click on “products”.    Finally, all of the methyl groups on the phosphates are removed at alkaline pH, and the linkage from  Monomer 1 to the glass support is cleaved.   Polymerase chain reaction (PCR) • • Usually the sequence of the vector is known. It is therefore simple to design a pair of primers that will  hybridize to a region at either side of the cloning site, and use these primers to PCR amplify a fragment  containing the inserted DNA • PCR amplification will then produce a product of a characteristic size, if you have cloned the right  piece of DNA.  You can screen a substantial number of potential recombinants in this way. • Once you have found one that does produce the correct size of product in the PCR, you can determine  the sequence of the PCR product to confirm the nature of the insert. PCR serves but one function, which is to amplify a relatively short segment of DNA many times, even if it  initially forms only a minute part of a very complex mixture. As we will see below, these procedure re­ quires  subjecting the sample to a cycle of defined temperature steps, including heating to 95◦C. • Use of a thermostable DNA polymerase called Taq polymerase.   • Like all other DNA polymerases, it requires a primer from which to start its synthesis. In fact, it is not a  particularly outstanding DNA polymerase. 4.1 The PCR reaction 1. we will be starting with genomic DNA purified from human buccal cells, collected by swabbing the  inside of the mouth with a cotton bud. 2. We will also need two primers. These can be synthesized to your specifica­ tions from a specialist  supplier at a very low cost within a couple of days 3. The binding, annealing, of the primer to the template is a typical DNA:DNA hybridization reaction, and  follows similar principles to the hy­ bridization of probes as described in Chapter 3. First, the double­ stranded template needs to be denatured. The temperature used for this in PCR, 95◦C, hardly does any  damage to the Taq polymerase molecule during the minute or so that the PCR reaction is heated to this  temperature. 4. The temperature is then lowered to the optimal annealing temperature, where the two primers can bind  to the opposing DNA strands 5. This is the only temperature in a PCR cycle that can be varied widely. It is chosen for the optimum  binding of the primers to the correct template, with a minimum binding of them to other, non­specific  sequences. Because the primers are short, and are used at relatively high molar concen­ trations,  annealing is rapid, taking less than a minute. 6. The temperature is then raised to approximately 72◦C, which is normally the optimum extension  temperature for a PCR reaction. The Taq polymerase will now produce complementary DNA strands  starting from the primers. The extension proceeds at approximately 1000 bases per minute 7. However, it is important to note that because the initial template in this case is many times larger than  the length of the desired amplicon, the poly­ merization will proceed until it is interrupted. This happens  when the tem­ perature is yet again raised to 94◦C in order to start the next cycle in the PCR reaction,  which consists of steps that are identical in temperature and duration to the previous ones. As we finish  the first PCR cycle, we have two double­stranded DNA molecules for each one that we started with. Figure 4.1 Polymerase chain reaction: first cycle • Figure 4.2 Polymerase chain reaction: second cycle Products between primers—  Basic steps:  ­Repeat in programmable machine ­graph = styrofoam “Number 1 fan” hand  Advantages:  4.2.1 Optimisation of the PCR reaction • Because G­C pairing is stronger than A­T pairing, with three hydrogen bonds rather than two occurring  between the bases, the more Gs and Cs there are in the primer, the stronger it will bind to its  complementary sequence in the template DNA, and therefore higher annealing temperatures can (and  must) be used. o Normally, the annealing tem­ perature is chosen somewhere between 40 and 60◦C, although for  templates with a high GC content annealing temperatures as high as 72◦C • Another important factor is the concentration of magnesium ions in the reaction mixture, as these are a  necessary cofactor for the Taq polymerase. Typically, a magnesium concentration of 1.5 mM is used. A  higher magne­ sium concentration usually gives a higher amplicon yield, but also a lower specificity.  Lowering the magnesium concentration increases specificity, but will decrease enzyme activity and,  hence, the amount of product produced. 1.  Making cDNA from mRNA  • Further experiments: Isolate rec DNA, and characterize further: restriction map, DNA seq, express,  mutagenesis in vitro etc. ­Some choices for preparing insert DNA for cloning 1. Cut DNA with restriction enzymes 2. Chemical synthesis of DNA 3. Polymerase chain reaction (PCR) 4. Making cDNA from mRNA 3.3.2 cDNA synthesis   Make a cDNA copy of mRNA Why make a cDNA? Advantage over genomic DNA cloneà  • A genomic library represents the entire DNA in the genome, whether it is expressed or not. But very  often it is really the genes that are being expressed that are our main target for investigation, and this is  likely to be quite a small proportion of the total DNA • So if we base our library on the mRNA extracted from the target cells, rather than on their DNA, we will  be able to focus more closely on the real target, and make the identification of the required clones much  more efficient. • The advantages of cDNA libraries, and their contrast with genomic li­ braries, extend further than that.  First of all, since introns are removed dur­ ing processing of the mRNA, the cDNA clones will reflect  only the coding regions of the gene (exons) rather than the much longer sequence contained in the  genome. This is especially relevant if we want to try to express the gene in a bacterial host, which would  be unable to splice out the introns. • Secondly, in any organism, some or most of the DNA does not appear to code for anything. This is often  referred to as junk DNA – but this term is misleading as many of these sequences are now known to  have regulatory functions • Finally, a library based on mRNA, rather than a genomic library, will re­ flect only those genes that are  actually expressed in a particular cell or tissue sample at a particular time. Any non­transcribed regions  will be excluded. • RNA isolation:  ­old methods similar to “classic” DNA prep with solvent extractions  ­now, use strong denaturing solutions (e.g. with urea, guanidine­HCl­­­ “Trizol”),  ­commercial kits—like genomic DNA kit.   ­Other precautions include baking all glassware, and use of RNase inactivators/ inhibitors.  ­Check RNA quality: gel electrophoresis (denaturing with formaldehyde)  Northern blot (Fig 6.1) 3.3.1 Isolation of mRNA Most of the RNA in a cell is not messenger RNA, but rather ribosomal RNA (rRNA) or transfer RNA (tRNA).  Any total RNA preparation will contain substantial amounts of rRNA and tRNA, and for construction of a  cDNA library it is highly desirable to purify the mRNA. • With eukaryotic cells, we can take advantage of the fact that mRNA carries a tail at the 3′ end – a string  of A residues that is added post­transcriptionally. Such polyadenylated mRNA will anneal to synthetic  oligo(dT) sequences Figure 3.6 Principle of oligo­dT purification of mRNA ­Selecting mRNA (exclude abundant rRNA, tRNA etc.): polyA tail binding to oligo­dT on a solid support  (column, paper).  Figure 3.7 Purification of mRNA through an oligo (dT) column 3.3.2 cDNA synthesis •  To make a cDNA copy of mRNA:  ­reverse transcriptase (RT) from retroviruses =your notes… ­Make TWO strands­­­ The presence of a poly(A) tail is also useful in the reverse transcription step (Figure 3.8). Reverse transcriptase,  like DNA­directed DNA polymerase, re­ quires a primer for initiation. An oligo(dT) primer will anneal to the  poly(A) tail; reverse transcriptase will then extend  this primer, using the mRNA as the template, and  will produce a single­stranded cDNA copy. Methods for making cDNA—different choices to   prime      strand synthes s (a) Classical methods (old, see text p90­93) (b) RT­PCR (Reverse transcription­PCR).  If  the sequence is known, choose defined  oligo primers for PCR  (c) Variations on RT­PCR—5’ and 3’ Rapid  Amplification of cDNA Ends (RACE) • Figure 3.8 Synthesis of cDNA from  mRNA (old, classical) One way of doing this is firstly to degrade the  RNA strand by alkali treatment. This leaves the  cDNA strand largely in single­stranded form.  Single­stranded nucleic acid molecules tend to  form secondary structures, looping back on  themselves, because of the hydrophobicity of the  bases. The single­stranded cDNA will therefore  tend to form a hairpin loop at the 3′ end. This  hairpin loop is used by DNA polymerase I to  prime synthesis of the second strand. The product is a double­stranded DNA molecule, with a hairpin loop at  one end. That loop is then removed by treatment with S1 nuclease (which will cut single­stranded DNA,  including exposed loops). • Figure 3.11 cDNA synthesis: enhancing representation of 5’ mRNA ends. (a) Oligo (dT) primer,  incomplete products; (b) random primers – enrich for 5¢ ends One limitation of these procedures is that you may not get a full­length cDNA in any individual clone.  Constraints such as elements of secondary structure in the mRNA may interfere with reverse transcription, so  that the enzyme rarely, if ever, reaches the end of the mRNA. As a result, the re­ gions at the 5′ end of the mRNA  may be under­represented in the cDNA library. This can be partially addressed by using random primers rather  than oligo(dT) primers. These random primers will initiate first strand cDNA syn­ thesis at intermediate points,  and hence the enzyme will be more likely to reach the 5′ end of the mRNA.   • You are unlikely to get any clones containing full­length cDNA, but these clones containing the 5′ end  can be compared to other clones carrying the missing 3′ portion, making it possible to devise strategies  for obtaining full­length molecules. The use of random primers rather than oligo(dT) primers also  overcomes the problem that some RNA molecules (e.g., bacterial mRNA and genomic RNA from viruses)  are not polyadenylated. • (b) Reverse Transcription (RT)­PCR to make cDNA    BE CAREFUL of possible acronym confusion: RT­PCR can also refer to Real Time PCR although most  people now use qPCR (for quantitative PCR) Alternatively, if you can predict the sequence of the ends of the mRNA, for example, from genome  sequence data, you can simply use a pair of specific primers for RT­PCR (reverse transcription PCR)  amplification (see Chap­ ter 4), which can generate your specific, full­length cDNA directly from even  small amounts of mRNA in your starting material. This bypasses completely the need for production and  screening of a cDNA library. 4.5 Reverse­transcription PCR • Combining reverse transcriptase (RT) with PCR, a procedure known as RT­PCR, extends the  application of PCR into the analysis of gene expression, either qualitatively or quantitatively, as well as  greatly facilitating the construction of cDNA li­ braries or the cloning of specific cDNAs. • One problem with RT­PCR is that the initial mRNA preparation may be contaminated with genomic  DNA. The PCR step can then result in amplifica­ tion of the contaminating DNA. When working with  eukaryotic material, this can often be overcome by designing the primers so that the amplicon spans at  least one intron. • In this way, amplification of any genomic DNA will either be prevented altogether (because the  presence of the intervening intron makes the sequence too large to be amplified), or at least it will be  readily distin­ guished from amplified cDNA (because of the different size of the product). Generally, it  is preferable to remove all traces of DNA from the mRNA, usu­ ally by treatment with RNase­free  DNase. If the mRNA sequence is known: 1  strand: generate the first strand with oligo­dT and RT (copy all mRNAs in the sample) text Figure 6.2, next  slide.   Alternative: use an oligo based on a specific sequence near the 3’ end of the mRNA.  Oligo called a  Gene Specific Primer or GSP.  Next: 2  strand:  Pick a specific sequence near the 5’ end of the mRNA, design an oligonucleotide to prime 2  strand  nd synthesis with a DNA polymerase.   THEN: Generate large amounts of this  cDNA via PCR using two GSPs. •  (c) 5’ and 3’    apid    mplification of     DNA     nds (RACE)  Use if you want an unknown 5’ (or 3’) end of a mRNA e.g. if you have only a portion of the mRNA sequence,  you aren’t sure where transcription starts (or ends).   Both 5’ and 3’ RACE:  ­only ONE defined sequence primer for PCR,  ­use a homopolymer sequence to set up the other primer site à can do PCR ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ 3’ RACE: ­1  strand, we start with an oligo­dT (plus added unique adaptor sequence for next rounds of PCR, because  oligo­dN sequences are not good primers).   ­Second strand use a GSP primer.   ­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­ 5’ RACE: ­first strand use GSP ­second strand: add a homopolymer tail (terminal transferase)à known sequence, complementary homopolymer  to prime 2  strand synthesis. Then use special primer that also has unique adaptor sequence for next rounds of  PCR (like the 1  strand of 3’ RACE). •  3’ RACE   Unknown 3’ sequence: ­1  primer = oligo­dT plus adaptor (unique seq for PCR, + restriction sites). ­2  primer is GSP  ­PCR amplify the product Note the differences between 3’ vs. 5’ RACE (see next slide), in terms of where to start, the GSP (which end of  the PCR reaction), etc.   •  5’ RACE   1  strand use random primers (?) or better still, a GSP chosen from a known sequence somewhere within the  mRNA  (not oligo­dT—may be too far from 5’ end, RT can’t go all the way to the 5’ end). ­Add homopolymer tail: make oligo­dC with terminal transferase plus dCTPs nd ­Special primer for 2  strand has oligo­dG PLUS extra unique anchor/adaptor (adapter) sequence. ­This extra anchor/adaptor àbetter than oligo­dG to prime specific PCR  WHY? oligo­dG primer can anneal to other sequences ànon­specific products.   The anchor/adaptor has defined restriction enz sites à convenient cut sites for cloning.     NOTE: Be careful­­­the term “adaptor” can describe other short d.s. sequences used to change or add restr sites  (method now obsolete, see future lecture on “ligating/joining DNA”).  Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a technique used in molecular biology to obtain the full length  sequence of an RNA transcript found within a cell. RACE results in the production of a cDNA copy of the RNA  sequence of interest, produced through reverse transcription, followed by PCR amplification of the cDNA  copies (see RT­PCR). The amplified cDNA copies are then sequenced and, if long enough, should map to a  unique mRNA already described, the full sequence of which is known. RACE can provide the sequence of an  RNA transcript from a small known sequence within the transcript to the 5' end (5' RACE­PCR) or 3' end (3'  RACE­PCR) of the RNA. This technique is sometimes called one­sided PCR or anchored PCR. The first step in RACE is to use reverse transcription to produce a cDNA copy of a region of the RNA  transcript. In this process, an unknown end portion of a transcript is copied using a known sequence from the  center of the transcript. The copied region is bounded by the known sequence, and either the 5' or 3' end. The protocols for 5' or 3' RACES differ slightly. 5' RACE­PCR begins using mRNA as a template for a first  round of cDNA synthesis (or reverse transcription) reaction using an anti­sense (reverse) oligonucleotide  primer that recognizes a known sequence in the gene of interest; the primer is called a gene specific primer  (GSP), and it copies the mRNA template in the 3' to the 5' direction to generate a specific single­stranded  cDNA product. Following cDNA synthesis, the enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) is used to  add a string of identical nucleotides, known as a homopolymeric tail, to the 3' end of the cDNA. (There are  some other ways to add the 3'­terminal sequence for the first strand of the de novo cDNA synthesis which are  much more efficient than homopolymeric tailing, but the sense of the method remains the same). A PCR  reaction is then carried out, which uses a second anti­sense gene specific primer (GSP2) that binds to the  known sequence, and a sense (forward) universal primer (UP) that binds the homopolymeric tail added to the  3' ends of the cDNAs to amplify a cDNA product from the 5' end. 3' RACE­PCR uses the natural polyA tail that exists at the 3' end of all eukaryotic mRNAs for priming during  reverse transcription, so this method does not require the addition of nucleotides by TdT. cDNAs are generated  using an Oligo­dT­adaptor primer (a primer with a short sequence of deoxy­thymine nucleotides) that  complements the polyA stretch and adds a special adaptor sequence to the 5' end of each cDNA. PCR is then  used to amplify 3' cDNA from a known region using a sense GSP, and an anti­sense primer complementary to  the adaptor sequence. ­Some choices for preparing insert DNA for cloning 1. Cut (genomic?) DNA with restriction enzymes 2. Chemical synthesis of DNA 3. Polymerase chain reaction (PCR) 4. Making cDNA from mRNA • Further experiments: Isolate rec DNA, and characterize further: restriction map, DNA seq, express,  mutagenesis in vitro etc. Vector options: ­Plasmids ­lambda phage ­cosmids  ­YACs  ­BACs ­other Lecture 3: Vectors Lab 2: Genomic DNA prep I. Plasmids:  desired optimal properties  strategies for selecting recombinants  pUC vectors            Composite plasmid vectors: pBluescript II. Phage lambda III. Cloning larger fragments: cosmids, YACs, BACs Lab 2: Isolating genomic DNA ­come prepared: know and understand the protocol/reagents, as well as the notes at the end of the lab handout  (for lab quiz). ­commercial kit:  we’re not doing an old­fashioned prep which removes proteins via extraction with organic  solvents (chloroform, phenol), followed by ethanol precipitation.  I’ll demo this in the lab.  We avoid the use of  hazardous chemicals, but the disadvantage is that you’re doing yet another “instant” kit prep. IMPORTANT: this is a kit, but you will have to pay attention to the steps and reagents to make sure that your  prep is successful.  I’d suggest writing out your own labelled flow chart in your lab book beforehand, so that  you’re well prepared.   IMPORTANT NOTE re: your genomic DNA: do a careful job, you’ll be using this to PCR amplify gene  sequences later in the term.  ***NOTE that in using this commercial kit, you have several different solutions with similar names  (ATL, AL,  AW1, AW2, AE) –make sure you are using the correct one at each step.   ***ALSO, as always,  be careful with hazardous chemicals, use the centrifuge properly (for binding, wash and  elution steps) i.e. balanced with lid attached, and please check the posted board instructions for any other  details. • Schematic of the Qiagen DNeasy kit • DNA extraction (see also lab handout: add your notes below) Homogenize cells and tissues: homogenization is a process whereby a biological sample is brought to a state  such that all fractions of the sample are equal in composition, i.e. a homogenized sample is mixed so well that  removing some of the sample does not alter the overall molecular make­up of the sample remaining, and is  identical to the fraction removed. Homogenization in biology is often followed by, or combined with, cell lysis  and/or molecular extraction. ­Lysis: refers to the breaking down of a cell ­RNase: is a type of nuclease that catalyzes the degradation of RNA into smaller components.  DNase: is any enzyme that catalyzes the hydrolytic cleavage of phosphodiester linkages in the DNA backbone,  thus degrading DNA. Deoxyribonucleases are one type of nuclease, a generic term for enzymes capable of  hydrolising phosphodiester bonds that link nucleotides.  proteinase K: Proteinase K is commonly used in molecular biology to digest protein and remove  contamination from preparations of nucleic acid. Addition of Proteinase K to nucleic acid preparations rapidly  inactivates nucleases that might otherwise degrade the DNA or RNA during purification. It is highly suited to  this application since the enzyme is active in the presence of chemicals that denature proteins, such as SDS and  urea, chelating agents such as EDTA, sulfhydryl reagents, as well as trypsin or chymotrypsin inhibitors. Separate DNA (or RNA) from other cellular components • Figure 2.4 Ethanol precipitation to concentrate nucleic acid samples Ethanol precipitation is a widely used technique to purify or concentrate nucleic acids. This is accomplished  by adding salt and ethanol to a solution containing DNA or RNA. In the presence of salt (in particular,  monovalent cations such as sodium ions (Na+)), ethanol efficiently precipitates nucleic acids. The purified  precipitate can be collected by centrifugation, and then suspended in a volume of choice. this can be collected at  the bottom of the test tube by centrifugation • A solute dissolves best in a solvent that is most similar in chemical structure to itself  • Figure 2.5 Purify small plasmid DNA circles via Alkaline denaturation. The procedure above provides us with a pure preparation of total DNA from the bacterial cell. • The next step is to separate the plasmid from the chro­ mosomal DNA, which can be done conveniently  by alkaline denaturation. • chromosomal DNA is broken into linear fragments during cell lysis. Raising the pH disrupts the  hydrogen bonds and allows the linear strands to separate. Plasmids are much less prone to breakage and  are not disrupted by cell lysis; they remain as intact supercoiled circular DNA. • When the pH is reduced, the interlinked plasmid strands will snap back to reform the double­stranded  plasmid • the separated linear chromosomal fragments will aggregate into an insoluble network that can be  removed by centrifugation, leaving the plasmids in solution. Detecting nucleic acids (add your notes) • If your DNA preparation is reasonably pure, then you can estimate the DNA concentration by measuring  the absorbance of the solution in an ultravio­ let (UV) spectrophotometer at 260 nm. • Note that the presence of proteins or phenol will affect this estimate, and the absorbance at 280 nm is  often used to assess such contamination, with a 260 : 280 absorbance ratio of between 1.75 and 2 be­  ing deemed reasonably pure. • Finally, UV absorbance gives you no check on the integrity of your DNA; it can be completely degraded  and still give you a reading. • Dyes such as ethidium bromide are commonly used for both detecting and quantitating nucleic acids.  Ethidium bromide has a flat ring structure that is able to stack in between the bases in nucleic acids; this  is known as intercala­ tion. The dye can be detected by its fluorescence when exposed to UV. • the most widely used method for staining electrophoresis gels, and can also be used for estimating the  amount of DNA (or RNA) in each band on the gel, by comparing the intensity of the fluorescence with a  sample of known concentration on the same gel. Adsorption Chromatography  Method using silica sorbents which or  chemically modified with polar  and/or hydrophilic functional  groups and in combination with  non­polar eluents. The most  popular sorbents are the amino­  and the cyanopropyl sorbent.  Both sorbents can be used for the  separation of neutral polar  compounds. Step 1: Prepare crude lysate Extraction Buffer composition  favors DNA and RNA adsorption  to silica:  • Low pH • High ionic strength • Chaotropic salt Apply to column Step 2: Adsorb to silica surface • Nucleic acids bind to the membrane, while contaminants pass through the column. • Chaotropic salts disrupt molecular structure based on hydrogen bonds (hydrophilic interactions);  promote denaturation of proteins and adsorption of nucleic acids onto silica in columns Step 3: Wash away residual contaminants Centrifuge Nucleic acids Step 4: Elute nucleic acids • Elution Buffer composition is unfavorable to surface binding:  • Low ionic strength (basically the reverse of step 2) Figure 2.6 Analytical gel electrophoresis. Using the standard marker to provide a calibration curve, the size  of fragment A is estimated as 2.5 kb and fragment B as 6.0 kb  NOTE: you’ll do this in the miniprep lab 3, week 4.   Gel electrophoresis: is a crucial technique for both the analysis and the pu­ rification of nucleic acids. • When a charged molecule is placed in an electric field, it will migrate towards the electrode with the  opposite charge; DNA and RNA, being negatively charged, will move towards the positive pole (anode). • the rate at which a nucleic acid molecule moves will be determined by its ability to pen­ etrate through  the pores. o For linear fragments of double­stranded DNA within a certain size range, this will reflect the size  of the molecule (i.e., the length of the DNA). • The effective size range of nucleotides that a gel can separate is determined by the gel’s composition.  We can use agarose gels for separating nucleic acid molecules greater than a few hundred base pairs, • For even smaller molecules, down to only a few tens of base pairs, we would use polyacrylamide gels. • it is invaluable for determining the size of DNA fragments from a restriction digest or the products of a  PCR reaction o it is necessary to calibrate the gel by running a standard marker containing fragments of known  sizes; in Fig­ ure 2.6, the marker is a HindIII restriction digest of DNA from the lambda  bacteriophage. o It can be seen that over much of the size range there is a lin­ ear relationship between the  logarithm of the fragment size and the distance it has moved. From this calibration graph, you  can then estimate the size of your unknown fragment(s) – assuming they are linear double­ stranded DNA (see below). Using the standard marker to provide a calibration curve, the size of fragment A is estimated as 2.5 kb and  fragment B as 6.0 kb. o If a more precise confirmation of the nature of the sample is required, the gel is blotted onto a  membrane support, and hybridized with a nucleic acid probe( southern blotting) It is therefore quite normal for a purified plasmid preparation to show two or three bands in a gel; it does  not necessarily mean that there is more than one plasmid. o a double­strand break will produce a linearized plasmid Most RNA molecules you will encounter are single­stranded, and in some cases you may come across  single­stranded DNA as well. These need spe­ cial consideration. o single­stranded nucleic acids tend to fold up into complex secondary structures, to remove the  hydropho­ bic bases from the aqueous environment. The migration of the molecule will be  greatly influenced by the way it folds. o If we want to get a true picture of its size, we have to make sure that it remains in an unfolded  state. To do this, we use denaturing gels, in which denaturing agents such as urea or formalde­  hyde are included, preventing the RNA or ssDNA molecule from forming a secondary structure. Lecture 3: Vectors Lab 2: Genomic DNA prep I.  Plasmids :  desired optimal properties  strategies for selecting recombinants  pUC vectors            Composite plasmid vectors: pBluescript II. Phage lambda III. Cloning larger fragments: cosmids, YACs, BACs • Further experiments: Isolate rec DNA, and characterize further: restriction map, DNA seq, express,  mutagenesis in vitro etc. Vector options: 1. ­Plasmids 2. ­lambda phage 3. ­cosmids  4. ­YACs  5. ­BACs 6. ­other • Plasmids: autonomously replicating, small double stranded (ds) DNA circles Desired, optimal properties in a vector: • ­small size (why)­ for convienience of manipulation.  And increases the amount of foreign dna that can  be inserted.   • ­ori: have elements necessary for their propagation and maintenance in E. coli such as a functional  origin of replication (ori). • ­This may be a multiple cloning site (MCS) which contains many unique restriction sites. • ­Two selectable markersà after transformation, want cells with vector+insert= recDNA (but exclude  recircularized vector with NO insert) • A selectable marker is carried by the vector to allow the selection of positively transformed cells.  Antibiotic resistance is often used as marker, an example is the beta­lactamase gene which confers  resistance to the penicillin group of beta­lactam antibiotics like ampicillin. • Reporter genes are used in some cloning vectors to facilitate the screening of successful clones by using  features of these genes that allow successful clone to be easily identified. Such features present in  cloning vectors may be the lacZα fragment for α complementation in blue­white selection, and/or  marker gene or reporter genes in frame with and flanking the MCS to facilitate the production of fusion  proteins. Examples of fusion partners that may be used for screening are the green fluorescent protein  (GFP) and luciferase. Cosmid Cosmids are plasmids that incorporate a segment of bacteriophage λ DNA that has the cohesive end site (cos)  which contains elements required for packaging DNA into λ particles. It is normally used to clone large DNA  fragments between 28 to 45 Kb ­genetically disabled: Biological containment may also involve the use of vector molecules and host organisms  which have been genetically disabled such that they can survive only in the peculiar conditions provided by the  experimenter and which are unavailable outside the laboratory. pBR322: early cloning vector:   The early cloning vectors (such as pBR322) are normally present in 15–20  copies per cell (although under special conditions they can be amplified to up to 1000 copies per cell). History and properties:  ­took genes from different plasmids in nature: antibiotic resistance genes, origin of replication ­nomenclature: plasmid Bolivar Rodriguez #322 ­has optimal properties listed, is ~4,300bp o pBR322 is a plasmid and was one of the first widely used E. coli cloning vectors o contains the replicon of plasmid pMB1, the amp  gene, encoding the ampicillin resistance protein  (source plasmid RSF2124) and the tet  gene, encoding the tetracycline resistance protein (source  plasmid pSC101). The plasmid has unique restriction sites for more than forty restriction enzymes. 11 of  R these 40 sites lie withiR the tet  gene. There are 2 sites for restriction enzymes HindIII and ClaI within  the promoter of the tet  gene. Schematic of cells after transformation with 2 selectable markers: AmpR (kill empty bacteria)  and lacZ’  (blue  vs. white selection, want white vector plus insert The blue­white screen is a screening technique that allows for the rapid and convenient detection of  recombinant bacteria in vector­based molecular cloning experiments. DNA of interest is ligated into a vector.  The vector is then transformed into competent cell (bacteria), and the competent cells are grown in the  presence of X­gal. Cells transformed with vectors containing recombinant DNA will produce white colonies;  cells transformed with non­recombinant plasmids (i.e. only the vector) grow into blue colonies. Lecture 3: Vectors Lab 2: Genomic DNA prep I. Plasmids:  desired optimal properties  strategies for selecting recombinants  pUC vectors            Composite plasmid vectors: pBluescript II. Phage lambda III. Cloning larger fragments: cosmids, YACs, BACs Strategies to select for recombinant plasmids (i.e. plasmid carrying insert)   Alkaline phosphatase treat the vector, remove 5’ Ps.     o the ligation process depends absolutely on the presence of a 5′­phosphate at the nick site. o Removal of 5′­phosphate groups is achieved with an enzyme known as alkaline phosphatase (because of  its optimum pH) o Ligation of vec­ tor to insert can occur, however, as the insert still has its 5′­phosphates. It is of course  important to remove the CIP enzyme before undertaking the ligation reaction •  Other strategies: forced or directional cloning  DNA insert and vector molecules are digested with two different restriction enzymes to create noncomplementary sticky ends at either end of each restriction fragment. This allows the insert to be ligated to the vector in a  specific orientation and prevent the vector from self­ligation. •  pUC plasmids— better selection strategies  o We may want to combine the expression signals of one gene with the coding region of another, or we  may want to insert addi­ tional markers that can be used to identify the presence of the plasmid. The  best way around this problem is to create a multiple cloning site (MCS), i.e., a short DNA region that  contains recognition sites for a number of different enzymes. Importantly, these restriction sites will  usually only appear once within the entire plasmid, meaning that they are unique to the MCS, increas­  ing their utility as sites for insertion of DNA. o pUC18, one of a family of similar plasmids that are commonly used as cloning vectors, and you will see  that pUC18 contains such a multiple cloning site. Insertion of a fragment into the BamHI site, as in  Figure 2.23, will still leave a selection of other sites available for further inserts. Properties and construction: ­TWO key features of pUC plasmids:  1.  insertional inactivation of b­gal (lacZ) activity  o The multiple cloning site is near to the 5′ end of a beta­galactosidase gene (lacZ′). The syn­ thetic  oligonucleotide that creates the multiple cloning site was designed so that it does not affect the reading  frame of the lacZ gene. o results in the production of beta­galactosidase with some additional amino acids near to the amino  terminus of the protein. o The product of the host gene is unable to hydrol­ yse lactose by itself, and so the host strain without the  plasmid is Lac−, i.e., it does not ferment lactose. When pUC18 is inserted into the host, the plasmid­  encoded polypeptide will associate with the host product to form a functional enzyme. We say that  pUC18 is capable of complementing the host defect in lacZ). o pUC18 carries a beta­lactamase gene (bla), coding for an enzyme that hydrolyses beta­lactam  (penicillin­like) antibiotics such as ampicillin (and hence often referred to as AmpR, for ampi­ cillin  resistance). o We can easily detect the activity of the beta­galactosidase by plating the or­ ganism onto agar  containing the chromogenic substrate X­gal, together with o The X­gal substrate is colourless but the action of beta­galactosidase releases the dye moiety,  result­ ing in a deep blue colour. Colonies carrying pUC18 are therefore blue when grown on  this medium o However, if we are successful in inserting a DNA frag­ ment at the cloning site, the gene will  (normally) be disrupted (Figure 2.23) and the resulting E. coli will be unable to cleave X­gal,  resulting in bacterial colonies referred to as ‘white’ due to their lack of blue coloration. Insertional inactivation: insert in lacZà no b­galàno conversion of X­galà NO blue, so you get a white colony.   Selection on the plate after transformation:  pick   whit  (recDNA) colonies,  ignore   blu  (vector DNA alone)  colonies   2. multiple restriction sites (inserted synthetic oligo with sites into plasmid à  pUC plasmids—  ­a smaller number e.g. pUC8 (vs. pUC18) indicates an earlier version with fewer restriction sites.  ­pUC18 and pUC19 are the same vector, but with the polylinker/MCS in opposite orientations Recall the lac operon: repressor, p, o, inducer etc.  B­gal catalyzes lactose à glucose and galactose • pUC cloning and selection: basic principle (oversimplified) BUT: Important!  NOT the complete story, extra details required to understand • pUC cloning: more necessary detail 1. pUC carries only the N­terminus of B­gal as lacZ’.  This encodes alpha­peptide, 146aa.  No B­gal  activity alone. 2. Requires special host cell: has only a part of lacZ gene (C­terminal part of B­gal), carried on an F­ plasmid. Again, there’s no active B­gal. 3. pUC in host cell: pUC provides N­terminus, host provides C­terminus of the proteinàfunctional B­gal  activity: called alpha­complementation (very unusual in biochem). 4. B­gal detection: IPTG induces, X­gal substrate à blue product. 5. Insertional inactivation: as described, but occurs within the small lacZ’ DNA.  Results in no alpha­ peptide, so no B­gal activityàwhite colony. 6. Must plate on ampicillin, to kill empty host cells (or get a white lawn)  Figure 2.23 A recombinant plasmid formed using the cloning vector pUC18. The lacZ gene has been disrupted  by insertion of a DNA fragment, resulting in white colonies on X­gal plates. bla, beta­lactamase (ampicillin  resistance) – selective marker; ori, origin of replication; lacZ’, beta­galactosidase (partial gene); lacI, repressor  of lac promoter. o Colonies are clones of genetically identical cells; blue cells contain vector alone; white cells contain  vectors with inserts NOTE: Special host with C­term lacZ is a KEY example of how important  it is to check the genotype of host  E. coli: different strains for different applics (more later e.g. different host genotypes for different phage lambda  vectors). •  pUC vectors: “Universal primers”  “Universal primers” for DNA sequencing: cloned insert sequences in pUC will be different, but the adjacent  vector sequences, next to the insert, will always be the same.   universal primers: sequencing primers derived from the sequence of the vector (pUC series); any insert can be  sequenced with the same primers The correct type of vector and competent cells are important considerations when planning a blue white screen.  The plasmid must contain the lacZα, and examples of such plasmids are pUC19 and pBluescript. • pUC: occasional complications • The ligated DNA may not be the correct one, and it is possible for some linearized vector to be  transformed, its ends "repaired" and ligated together such that no LacZα is produced and no blue  colonies may be formed.  • A colony with no vector at all will also appear white, and may sometimes appear as satellite colonies  after the antibiotic used has been depleted. It is also possible that blue colonies may contain the insert.  This occurs when the insert is "in frame" with the LacZα gene and a STOP codon is absent in the insert.  This can lead to the expression of a fusion protein that is still functional as LacZα. •  The correct recombinant construct can sometimes give lighter blue colonies, which may complicate its  identification. 1. Blue recombinants (pale blue?) with insert.  Why?  There’s still a (partially) functional alpha­peptide, even with an insert.  How?  In this method of screening, the host E. coli strain carries the lacZ deletion mutant (lacZΔM15} which contains  the ω­peptide, while the plasmids used carry the lacZα sequence which encodes the first 59 residues of β­ galactosidase, the α­peptide. Neither is functional by itself. However, when the two peptides are expressed  together, as when a plasmid containing the lacZα sequence is transformed into a lacZΔM15 cells, they form a  functional β­galactosidase enzyme. 2. Rarely, you get your cloned insert in only one orientation/ direction; you can’t get the other.   Why?   Composite plasmid vectors: pBluescript o is a commercially available phagemid containing several useful sequences for use in cloning with  bacteriophage. The sequences include a multiple cloning site sequence (MCS), antibiotic resistance  sequence to ampicillin and an E. coli and f1 helper phage origin of replication. • pBluescript: like pUC, plus extra features • The multiple cloning site sequence is located within a LacZ controlled gene designed to provide a blue  coloration when expressed in bacteria. This is usually achieved via X­gal found in agarose growth  media used to culture bacteria with pBS • The pBluescript II phagemids (plasmids with a phage origin • The pBluescript II phagemids have an extensive multiple cloning site with 21 unique restriction enzyme  recognition sites. Flanking the multiple cloning site are T7 and T3 RNA polymerase promoters that can  be used to synthesize RNA in vitro. 1, 2 Properties: commercial design (Stratagene), phagemid (phage plus plasmid) vector ­small (3,000bp), blue/white selection with lacZ’ ­MCS/polylinker site is different from that in pUC­­­useful to have choices.  Like pUC18/19, there are pairs of  related vectors with have MCS in either orientation: KS indicates direction is KpnI to SacI, or SK (SacI to  KpnI).   Two extra features:  1. ­flanking phage T3 and T7 promoters:  o The choice of promoter used to initiate transcription determines which strand of the insert cloned  into the multiple cloning site will be transcribed. o The multiple cloning site and T7 and T3 RNA polymerase promoter sequences are present in the  N­terminal portion of a lacZ gene fragment. o pBluescript II phagemids that have inserts will produce white colonies using the same strain,  because the inserts disrupt the coding region of the lacZ gene fragment. 2. –add a replic origin from M13 single­stranded (ss) DNA virus.. o pBluescript II phagemids can be rescued as single­stranded (ss) DNA. pBluescript II phagemids  contain a 454­bp filamentous f1 phage intergenic region (M13 related), which includes the 307­bp  origin of replication. Adding features  1. use special phage promoters to make RNA copies of cloned inserts : T3, T7 viruses.    ­After infecting E. coli, these viruses make a new, phage­specific RNA polymerase  i.e. T3 RNA pol recognizes ONLY T3 phage genes, not E. coli genes (a strategy to take over cell).   ­Take advantage of this property: Design vectors with phage promoter upstream of insertion siteà allows you to  … o The choice of promoter used to initiate transcription determines which strand of the insert cloned  into the multiple cloning site will be transcribed. o Flanking the T3 and T7 promoters are BssH II sites. This rare six­base cutter will allow the insert  plus the T phage RNA promoters to be excised and used for gene mapping.   **Must use phage promoter and enzyme.   ­NOT E. coli RNA pol, because  • Adding features 1. use special phage promoters(cont’d): 1. Basic cloning: clone insert in correct orientation behind promoter 2. Isolate plasmid DNA, cut with restriction enzyme downstream (3’) of insert (stop RNA pol at the end of  the insert)    3. In vitro, in a test tube, add viral RNA pol, rNTPs, make an RNA copy of insert.   NOTE: need to carefully consider which strand you want to copy! ­making a labelled probe (use labelled rNTPs): which strand to detect mRNA on a Northern blot?  OR ­making RNA to serve as a synthetic mRNA, or pre­mRNA to assay splicing? • Adding features   • 2. add a ssDNA phage origin, allowing you to make ssDNA circular copies of your insert DNA • ­M13 Life cycle: double­stranded (ds) RF intermediate of this phage looks just like a plasmid ds  circle i.e. like pBS.  ssDNA virus molecules are then copied from this dsRF template. • ­pBS Protocol: clone inserts into pBS­put into virus­infected cells­virus/cells think pBS is an  RF, will use it like an RF to make single­stranded (ss) DNA circles of pBS à ss circular copy of  your insert DNA.  • ­History: making ssDNA was required for DNA sequencing and in vitro mutagenesis.  Now  obsolete, so we won’t deal with this application further.   II. Phage lambda • Phage lambda Summary (text p61 and following) ­rarely used these days, but provides insights into how today’s tools were developed, and how molecular  biologists think. ­review genome, “lifestyles” and gene expression ­2 different types/designs of lambda vector ­strategies for selecting recombinants: different lambda phage vectors future lecture: ­making libraries: choice of vector, how many clones to have a representative library, etc. ­packaging rec DNA into lambda phage libraries **Plasmid vectors are at their best when cloning relatively small fragments of DNA. o Vectors based on bacteriophage lambda allow efficient cloning of larger fragments, which is important  in constructing gene libraries. The larger the inserts, the fewer clones you have to screen to find the one  you want • Lambda genome: key features 50kb genome has a few functional clusters, and cohesive ends that are 12nt long, that allow conversion of linear  into circular phage DNA Head/tail       Integration/recombination      early       DNA synth  late/lysis             cos­­­­­­­­­­­­­­­|­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­|­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­cos           (can delete this middle part) Lambda as a vector :   o When you add a lambda phage preparation to an E. coli culture, some of the infected cells will become  lysogenic, and some will enter the lytic cycle. o Some phage mutants will only produce lytic infection, and these give rise to clear plaques, while the  wild­type phage produces turbid plaques due to the presence of lysogenic cells which are resistant to  further attack by lambda phage Recall two “lifestyles”: ­lytic cycle­  o In the lytic cycle, this circular DNA structure is initially repli­ cated, in a plasmid­like manner (theta  replication), to produce more circu­ lar DNA. o replication switches to an alternative mode (rolling circle replication), which generates a long linear  DNA molecule o the genes carried by the phage are being expressed to produce the components of the phage particle.  These proteins are assembled first of all into two separate structures: the head (as an empty precursor  structure into which the DNA will be inserted), and the tail (which will be joined to the head after the  DNA has been packaged).­ making asymmetric cuts in the DNA at these positions. o These staggered breaks in the DNA give rise to the cohesive ends seen in the mature phage DNA; these  sites are known as cohesive end sites (cos sites). o length of DNA that will be packaged into the phage head is deter­ mined by the distance between the  two cos sites. Limitation 1: packaging limits.   o If we insert a piece of DNA into our lambda vector, we will increase that distance, and so the amount of  DNA to be packaged will be bigger. But the head is a fixed size, and can only accommodate a certain  amount of DNA o The way round this potential problem is to delete some of the DNA that is normally present.  o genes that are not absolutely necessary – especially if we only need lytic growth, meaning we  can delete any genes that are required solely for the establishment of lysogeny. o But we cannot delete too much. The stability of the phage head requires a certain amount of  DNA      • Lambda as a vector Recall two “lifestyles”: ­lysogeny­ cI repressor gene: In the lysogenic state, expression of almost all of the phage genes is switched off  by the action of a phage­encoded repressor protein, the product of the cI gene. However, some bacterial host strains carrying a mutation known as hfl (high frequency of lysogenization)  produce a much higher proportion of lysogens when infected with wild­type lambda, which can be useful if we  want a more stably altered host strain, for example, if we are studying the expression of genes carried by the  phage. Generally, when using lambda vectors we are more interested in the recombinant phage carrying the  cloned genes, and the lytic cycle is the more relevant one in such cases. ­Phage DNA  ­the virus hides  ­Escape/excision (induce lytic cycle):  • Lambda as a vector          Head/tail     Integration/recombination       early        DNA synth  late lysis   cos­­­­­­­­­­­­­­­|­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­|­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­­cos Lambda: vector design ­use the lytic cycle When you add a lambda phage preparation to an E. coli culture, some of the infected cells will become  lysogenic, and some will enter the lytic cycle. o Some phage mutants will only produce lytic infection, and these give rise to clear plaques, while the  wild­type phage produces turbid plaques due to the presence of lysogenic cells which are resistant to  further attack by lambda phage ­PACKAGING RULE:  ­one genome length DNA (cos to cos) o One of the most important features of this process from our point of view is that the length of DNA that  will be packaged into the phage head is deter­ mined by the distance between the two cos sites o ­the central int/rec region can be removed; this leaves  room for … • Two types/designs of lambda vector The existence of these packaging limits is a very  important  feature of the design and application of lambda vectors,  and also of  cosmids, which we will discuss later.  1 .      Insertional vector :   Gt10:  The simplest form of lambda vector, known as an  insertion vector,  is similar in concept to a plasmid vector, containing a  single cloning  site into which DNA can be inserted. o cut a circular DNA molecule once and you  still have one.   fragment; cut linear DNA once and you  have two  fragments.) o all lambda vectors have been genetically manipulated to remove unwanted restriction sites. o lambda gt10. In this vector, there is only a single site at which EcoRI will cut the DNA. The  manipulations that this phage has undergone have removed the unwanted sites, and have also  reduced the overall size o Cutting this vector with EcoRI will produce two DNA fragments, referred to as the left and right  arms. o ­missing ~10kb relative to wild­type lambda.  ­smaller, 40kb­­­its DNA is still large enough to be packaged.   ­has one central restriction siteàcut open the vector and insert up to 10kb inserts.  ­So cloned inserts must be smaller than 10kb (0 10kb, no, too big  ***|      7­20kb, yes ******| *******| ***********|  >20kb, no, too big  2 .      Alkaline phosphat  treat the vector arms (just like plasmid); the arms can’t reanneal to each other,  but can ligate to an insert. the ligation process depends absolutely on the presence of a 5′­phosphate at the nick site. If this phosphate  group is removed, that o ite cannot be ligated. Removal of 5′­phosphate groups is achieved with an enzyme known as alkaline  phosphatase (because of its optimum pH) – one commonly used enzyme is calf intestinal phosphatase  (CIP). Lambda as an expression vector: vectors carrying lacZ (lambda gt11) or lacZ’ (lambda ZAP)  If an insert is “in frame” translationally with the beginning of the b­gal protein, a fusion protein results­­ the N­ terminus of b­gal is followed by whatever protein is encoded by the insert  (also true for pUC and pBS  plasmids).  This provides a strategy to clone the gene for a particular protein—even if you don’t have a nucleic acid probe  or sequence to design PCR primer—you can still clone it, IF you have an antibody to recognize the protein  product. Screening an expression library: thousands of different phage, each expression a different insert.  The  resulting plaques would each contain a different protein (coded by insert DNA).  You can detect the desired  clone by using a specific antibody (more on this later, in strategies to clone genes) Note: you could do the same with pUC or pBS •  Summary of lambda vector types:   Insertion: 0­10kb—small inserts like cDNA libraries:  gt10 (cI selection), gt11 (lacZ selection), ZAP (lacZ’  selection).   Replacement/Substit:   7­20kb­­ big overlapping pieces as in a genomic library: EMBL4 phage Cloning larger fragments: cosmids, YACs, BACs Cosmids pg 71 Cosmid = a plasmid (typical AmpR, plasmid ori and cloning sites).   Also contains one or more lambda cos sites (hence “cosmid”) to allow packaging in vitro of recombinant DNA  into lambda phage particles.    Rarely used now: allow bigger inserts than lambda vectors­­it’s a small vector (~5kb), so in order to get  packaged, an insert will be very large (35­45kb), because packaging requires 40­50kb total. Basically, a cosmid is simply a plasmid that contains a lambda cos site. As with all plasmid vectors, it has an  origin of replication, a selectable marker (usually an antibiotic resistance gene) and a cloning site. o Digestion, ligation with the potential insert fragments, and subsequent purification of recombinant  clones, are carried out more or less as for a normal plasmid vector o However, instead of transforming bacterial cells with the ligation mix, as you would with a plasmid, you  subject the ligation mixture to in vitro packaging as described in Section 2.10.2 for lambda vectors.  Since the cosmid carries a cos site, it can be a substrate for in vitro packaging – but only if it is big  enough. o The packaging reaction will only be successful if you have inserted a DNA fragment between about 32  and 45 kb in size. o although they are phage­ like particles, will not give rise to more phages after infection of a host bac­  terium. They do not carry any of the genes that are needed for production of phage particles, nor for  lysis of the cell. So you will not get phage plaques. But the cosmid will replicate as a plasmid, and  hence will give rise to more cosmid­containing cells, and these can be selected as colonies on agar con­  taining an antibiotic (in this case ampicillin). Schematic basic cloning experiment for a cosmid: 1.  cut cosmid with BamHI 2.  prepare size­selected large inserts (35­45kb), after partial Sau3A digestion 3.  Ligate 4.  Package (just as for lambda phage) 5.  Mix packaged phage particles (but with cosmid DNA inside a lambda coat)  with host E. coli 6.  Cosmid DNA is injected by phage apparatus. 7.  Because there are no lambda genes carried on the cosmid, once the DNA gets into the host (injected from the  phage coat into the cell) there is no programmed lysis.  Instead, the cosmid survives in the host as a giant  plasmid, and the host cell becomes AmpR and survives on Amp plates.   SO:  you get colonies with giant plasmid, NOT plaques with cosmids. YACs: Bacterial plasmid features (important, but not shown in the fig in your text) These allow you to grow up large quantities of vector DNA prior to doing an experiment—it’s easier to grow  and prepare plasmid DNA in bacteria. plasmid ori—allows replication in bacteria AmpR­selectable marker in bacteria •   YACs: Yeast vector features:     o ­yeast origin of replication, ARS (autonomously replicating sequence)  o ­markers to select for the presence of a YAC—nutritional TRP1 and URA3 genes (host is mutant for  both and can’t make trp, ura).  The plates have no trp, ura,  so only yeast cells that get a YAC will  survive.  o ­CEN (centromeric) sequences—this allows proper segregation of replicated DNA during cell division.   o ­TEL (telomeric) sequences—provide chromosome ends in the yeast cell o ­cut with SnaBI as an insertion site, cut with BamHI to provide telomere ends o a YAC vec­ tor is propagated as a circular plasmid in E. coli. Restriction enzyme diges­ tion removes  the stuffer fragment between the two telomeres, and cuts the remaining vector molecule into two linear  arms, each carrying a selectable marker. o The insert is then ligated between these arms, as in the case of phage lambda, and transformed into a  yeast cell, with selection for complementa­ tion of auxotrophic markers; this ensures that the  recombinants contain both arms. o Furthermore a successful recombinant must contain the tel sequences at each end, so that the yeast  transformant can use these sequences to build functional telomeres. o YACs are routinely used to clone 600 kb fragments, and specialized versions are available that can ac­  commodate inserts close to 2 Mb, which is approximately one thousand times more DNA insert than in a  plasmid. o YACs: Yeast vector features:     • ­Possible problems with YACs include potential instability of inserts—you can get rearrangements, loss  of sequences etc. (especially if repetitive sequences are present) and not get a true picture of the  chromosomal DNA you’re trying to study.  • NOTES re: selectable cloning site in YACs: insertional inactivation, to select cells containing YAC plus  insert.  • ­Select for recombinants via insertional inactivation of the sup4 gene (cut and insert in  SnaB1 site).    •  Sample exam question:   Discussion in class on the overhead projector. NOTE:  Temperature­sensitive (ts) mutations are another very useful class of conditional mutation.  At low  temp, gene/protein function is fine, but at high temperature, gene/protein function is lost.  These were a key tool  to look for mutations in genes that are essential for life (e.g. DNA polymerase).  Can grow mutants at low temp,  and look for phenotypes/effects of mutations only at high temps.    - relatively small (under 10kb)  - carries antibiotic resistance   - a stable origin of replication from an F plasmid (and other F genes that assist in even distribution  of BACs to daughter cells),  - restriction sites for inserting foreign DNA - markers for selection and other features for cloning/manipulation.   - After ligation of large inserts (100­300kb) into cut vector, the recDNA is introduced into host by  electroporation, where it behaves like a giant plasmid (see next slide). However, YACs have problems with the stability of the insert, especially when working with very large  fragments as these can be subject to rearrange­ ment by recombination. Furthermore, apart from the fact that  many labora­ tories are not set up for the use of yeast vectors, the recombinant molecules are not easy to  recover and purify. • Thus, larger bacterial vectors are used more than YACs even though their capacity is lower. These  include vectors based on bacteriophage P1, which are able to accommodate inserts in excess of 100 kb,  and bacterial artificial chromosomes (BACs), which are based on the F plasmid and can accommodate  300 kb of insert. These vectors are more stable than YACs, and have played an important role in  genome sequencing projects • LECTURE 4:  • lecture 4 summary Finish lec 3 vectors: cosmids, YACs, BACs (previously posted slides) Lab: miniprep, restriction digestion and agarose gel Cutting and Joining/Ligating DNA (Ch 2) (i) Properties of T4 DNA Ligase   (ii) Strategies to put compatible ends on inserts for ligation to vector DNA Plasmid miniprep lab  (read posted docs on canvas,  w   atch the recommended videos—all quiz material  ) • One miniprep and one gel box setup per group—if you are a “pro”, let your inexperienced partner do  more? •  Miniprep protocol  : read ahead of time (flow chart in your lab book?) and follow the protocol carefully.  Same principle as genomic DNA prep kit. • careful when gel pouring (microwave, hot!) and when using restr enzymes, correct DILUTION of  SybrSafe, (SAFETY if using EtBr) •  Gel electrophoresis : different buffers, practice loading your gel again?, marker ladder, be careful re: gel  box setup i.e. pos vs neg electrode, importance of having appropriate V and current.   • Gel documentation system: different options possible • Remember appropriate WASTE disposal etc., and    CLEAN UP    after l . Figure 2.6 Analytical gel electrophoresis. Using the standard marker to provide a calibration curve, the size  of fragment A is estimated as 2.5 kb and fragment B as 6.0 kb  • agarose gel electrophoresis: make your gel after the mi
More Less

Related notes for MBB 308

Log In


Don't have an account?

Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.