Study Guides (238,487)
Canada (115,165)
MBB 308 (2)

MBB308 midterm 2 notes

24 Pages
Unlock Document

Simon Fraser University
Molec Biol & Biochem
MBB 308

Lecture 7 ­­­­end:  Isolate a piece of cloned DNA: what next? (sometimes unnecessary e.g. PCR product, or well­ defined clone from genome project or ?)  ­Restriction mapping and subcloning ­Preliminary functional analysis (locate genes?) ­Sequencing/sequence analysis  ­Further gene characterization: characterizing RNA  transcripts (5’ RACE, primer extension/S1 mapping  etc.), mapping of exons/introns, expression patterns  etc. ­Genomics: mapping and sequencing genomes  (more later) Restriction mapping Restr map is characteristic of a particular DNA sequence.  Useful to confirm identity of an  unknown clone/sequence; or as first step in characterizing a novel piece of DNA.  If very large  (e.g. insert from BAC or other library), you can cut into smaller fragments and “subclone”  these into plasmid.  Methods: 1.  RECALL: single and double digests—jigsaw puzzles.   AND: pUC, pBS type vectorsàhave single sites in polylinker/MCS to provide extra  information for mapping insert. 2. If too many sites to map, use end­labelling and partial restriction digestion (see next  slide).   NOTE:  Most of the time, doing this kind of extra work/analysis is OBSOLETE —genomics provides maps/data, or people just sequence long stretches of DNA (see  later in lecture).  Still useful to show the thought processes involved­­­ using mol biol  tools to solve problems. Restriction mapping by end­labelling and partial restriction digest(thought experiments,  obsolete now ) ­end­label one end only (left or right)—this is the tricky part ­partial digestion with restr. enzyme  a mix of fragments, but only a subset are labelled (at one end) ­visualize ONLY labelled fragments e.g. by autoradiography RESULTS à an instant map: ­The sizes of the bands correspond to the distances of the restriction sites, from the labelled  end • How do you label one end only e.g with 32P? ­kinase and gamma­32P­ATP, or  ­Klenow end­filling a 5’ overhang.   But  d.s. DNA will be labelled on both ends— Possible Solutions (thought experiments, all obsolete now ): (a) Cut and gel­purify two separate DNA fragments ­End­label both ends,  ­cut asymmetrically into two different sized pieces ­separate on a gelà two different pieces of DNA ­each is labelled at one end only (see next slide). Disadvantages: inconvenient/safety—handling gels with radioactive DNA etc. (b) Insert in pUC or pBS (again, this is rarely done any more) ­cut at two different polylinker sites to produce: ­5’ overhang next to the insert, and ­3’ overhang at the other end (vector side).   ­End­label: Treat with Klenow + a­32P­dNTP, (or kinase and g­32P­rATP)—only the end with  the 5’ overhang (next to the insert) is labelled. ­NOTE: it’s important to choose enzymes which DON’T cut in the insert. End­labeling. This type of procedure involves addition of a labeled group to one or a few  terminal nucleotides. It is less widely used, but is useful for a number of procedures, including  labeling of single­stranded oligonucleotides (see below) and restriction mapping. Inevitably,  because only one or a very few labeled groups are incorporated, the specific activity (the  amount of radioactivity incorporated divided by the total mass) of the labeled DNA is much  less than that for probes in which there has been incorporation of several labeled nucleotides  along the length of the DNA. End­labeling of DNA using 32P Single­stranded oligonucleotides are usually end­labeled using polynucleotide kinase (kinase  end­labeling). Typically, the label is provided in the form of a 32P at the γ­phosphate position  of ATP and the polynucleotide kinase catalyses an exchange reaction with the 5′­terminal  phosphates Figure 5.3End­labeling of DNA (A) Kinase end­labeling of oligonucleotides. The 5′­terminal phosphate of the  oligonucleotide is replaced in an exchange reaction by the 32P­labeled γ­phosphate  of [γ­32P]ATP. The same procedure can be used to label the two 5′ termini of  double­stranded DNA. (B) Fill­in end­labeling by Klenow. The DNA of interest is  cleaved with a suitable restriction nuclease to generate 5′ overhangs. The overhangs  act as a primer for Klenow DNA polymerase to incorporate labeled nucleotides  complementary to the overhang. Fragments labeled at one end only can be  generated by internal cleavage with a suitable restriction site to generate two  differently sized fragments which can easily be size­fractionated. Preliminary functional analysis (roughly locate genes?) Large piece of “unknown” DNA (e.g. 15kb or more), maybe you don’t want to sequence the  whole thing ànarrow your analysis to “interesting” parts of the DNA e.g.  gene(s)/transcripts/exons and introns/control regions etc.  How to find these “interesting” portions (genes?) within a larger DNA clone?  In theory  several possibilities, but in practice now, mainly DNA sequencing.  1. Southern blot. Cut large DNA, blot, probe with cDNA to position gene X (exons etc.)  within the large DNA.  2. Northern blots.  Take large DNA and subclone into smaller pieces.  Use as probes on  Northern blots, to determine which pieces of the large DNA encode mRNA (i.e. are  exons). 3.      Evolutionary conservation—Southern blots to DNA from related organisms.  If a gene  sequence is functionally important, it is often conserved.  Cut large DNA into smaller pieces.   Then use each as probes to blots of genomic DNA from another organism.  If it hybridizes, it  contains a conserved sequence =  gene? 4. Heteroduplex mapping: for abundant mRNAs.  Isolate and anneal to DNA, look in the  E.M.  If there are introns, they should loop out (R­loops).  5. BUT most commonly now  : DNA sequencing and computer prediction of genes etc.   Above methods are time­consuming and less relevant.   • functional analysis (continued) For hypothetical gene X: Further analysis: to prove that the cloned DNA actually encodes the predicted protein (e.g. if  we haven't detected the protein in vivo)? (a) Try expression of the DNA in vitro (make synthetic mRNA and translate in vitro); do we  get a polypeptide of the predicted size? (b) from the predicted protein sequence, synthesize peptides. Use these to produce antibodies,  and use these antibodies as tools to try to detect the protein in vivo. (c) if it may correspond to a genetic locus which is responsible for problems when mutated?  Try rescue e.g. transgenic animal: introduced X clone will fix the mutant X­ defect • DNA sequencing—a next step to characterize DNA Sanger enzymatic “dideoxy” sequencing: ­Enzymatic synthesis of complementary strand that terminates at specific nucleotides. Have  four tubes, each with DNA polymerase, primer and dNTPs. Each tube also has just one of the  four ddNTP i.e. ddATP, ddCTP, ddGTP, or ddTTP.  ­If a ddNTP is added to a growing DNA chain, the sequence is terminated, because another  base cannot be added.  ­Aim for “partial” termination i.e. in ddATP tube, don’t all stop at first A in the sequence.  However, the Sanger method is still routinely used for sequencing individual cloned genes, or  PCR­amplified fragments of DNA. The principle of the Sanger method, also known as dideoxy sequencing, is illustrated in  Figure 5.1. To understand the dideoxy procedure it is necessary to remember two fundamental  facts about DNA synthesis. Firstly, synthesis of a DNA strand does not start from scratch. It  requires a primer annealed to a template strand. Synthesis of the new  strand works by adding bases to the primer that are complementary to  the template, extending the sequence. Thus, by using a primer that  binds to a specific position on the template, we can ensure that all the  new DNA that is made starts from the same point. Secondly, the  addition of bases to the growing strand occurs by formation of a  covalent phosphodiester bond between the 5′­phosphate on the  nucleotide to be added and the 3′­OH group on the existing molecule.  The substrate for this reaction is a 5′­dNTP, i.e., a deoxynucleotide with  three phosphates at the 5′­position of the deoxyribose sugar; two of  these phosphates are eliminated in the reaction. The sugar part of the natural substrate is more specifically a 2′­ deoxyribose. This means that it does not have a hydroxyl group at the  2′­position (which distinguishes it from the ribose sugars that occur in  RNA). But it does have a 3′­OH group, which is necessary for the  formation of the next phosphodiester bond when a subsequent nucleotide is incorporated into  the DNA strand. What happens if we use, instead of the natural substrate, one in which there is  no 3′­OH group, i.e., a 2′,3′­dideoxy derivative (ddNTP; see Figure 5.2).  • Figure 5.2 2’­Deoxyribose and 2’,3’­dideoxyribose  ▯ • Figure 5.3 Chain termination by ddNTP So if we replace one of the dNTPs with a dideoxy derivative – for exam­ ple, if we use a  mixture of dGTP, dCTP and dGTP (the normal substrates) but replace dATP with the relevant  2′,3′­dideoxy derivative (ddATP) – then DNA synthesis will proceed only as far as the first A  residue, after which it will stop (Figure 5.3). If we carry out a set of four such reactions, in each case replacing one of the dNTPs with its  corresponding ddNTP, we would pro­ duce four molecules of different lengths, each  proceeding just as far as the first occurrence of the relevant nucleotide in the sequence. Just determining the first occurrence of each base would not be much use. However, instead of  completely replacing, say, dATP with ddATP, we can use a mixture of the two nucleotides,  with most of these bases being the nor­ mal dATP. So, at the first T residue in the template, a  few molecules of the new strand will have ddA added (and will therefore terminate), but most  will have the normal A residue incorporated, and the reaction will be able to pro­ ceed. At the  next T in the template, some more molecules will terminate, and so on. We will thus have a  series of molecules of different chain lengths, each ending with ddA, corresponding to a T in  the template these can be separated by electrophoresis in a polyacrylamide gel, using denatur­ ing  conditions to prevent the DNA strands from folding up. The molecules are separated on the  basis of their size, with smaller molecules running faster through the gel. We therefore get a  series of fragments, corresponding to the positions of A residues in the new strand (T residues  in the template). With a set of four reactions, each using a different ddNTP, we get a set of  four lanes, from which the sequence can be read as shown in the figure. Because the smallest fragments (which are closest to the primer) will migrate faster, they will  be at the bottom of the gel; the autoradiogram is therefore read from bottom to top. However,  manual sequencing has now largely been replaced by automated sequencing. • ­Principle: Four separate reaction tubes, each with only ONE ddNTP present. ­In ddATP tube, get products of different lengths, which depend on position of A in the  sequence.  Separate these fragments on long polyacryl gels (can separate n vs. n+1 nts  long).   Example below: primer is “n” nts long, synthesize on sequence shown.  Primer ­­­­­­­­­G A T G C A T Tube: G  ddGTP A  ddATP T ddTTP C ddCTP  this slide: fill in for G  • ­Principle: Four separate reaction tubes, each with only ONE ddNTP present. ­In ddATP tube, get products of different lengths, which depend on position of A in the  sequence.  Separate these fragments on long polyacryl gels (can separate n vs. n+1 nts  long).   Example below: primer is “n” nts long, synthesize on sequence shown.  Primer ­­­­­­­­­G A T G C A T Tube: G  ddGTP A  ddATP T ddTTP C ddCTP this slide: fill in for A  • ­Principle: Four separate reaction tubes, each with only ONE ddNTP present. ­In ddATP tube, get products of different lengths, which depend on position of A in the  sequence.  Separate these fragments on long polyacryl gels (can separate n vs. n+1 nts  long).   Example below: primer is “n” nts long, synthesize on sequence shown.  Primer ­­­­­­­­­G A T G C A T Tube: G  ddGTP A  ddATP T ddTTP C ddCTP this slide: fill in for T  • ­Principle: Four separate reaction tubes, each with only ONE ddNTP present. ­In ddATP tube, get products of different lengths, which depend on position of A in the  sequence.  Separate these fragments on long polyacryl gels (can separate n vs. n+1 nts  long).   Example below: primer is “n” nts long, synthesize on sequence shown.  Primer ­­­­­­­­­G A T G C A T Tube: G  ddGTP A  ddATP T ddTTP C ddCTP this slide: fill in for C  • ­Four separate reaction tubes, each with only ONE ddNTP present. ­Load each tube in separate lane, and electrophorese these fragments on long polyacryl  gels (can separate n vs. n+1 nts long). ­Read the sequence from the bottom up. ­The results are a bit like the restriction mapping application: the sizes of the bands in  each lane represent increasing distances from the primer e.g. in the C tube there are  bands n+1 and n+4, which means that there are C’s in these positions.   PrimerC* Draw gel and bands here ­­­­­­­­­G A T G C A T PrimerC T A C* ­­­­­­­­­G A T G C A T Tube:            length of product(s) G  ddGTP           n+5 A  ddATP        n+3, n+7 T ddTTP         n+2, n+6 C ddCTP        n+1, n+4 Sanger sequencing Older obsolete technology: Visualizing bands on the gel—need to label products of synthesis.  • Use 32P, 33P or 35S alpha­dNTP, incorporated into products  • Use labeled primers, or labelled ddNTPs (see below). DNA polymerase?  Klenow, and then “Sequenase” (modified T7 DNA polymerase), which  does one round of DNA synthesis on template • need a lot of template e.g. >1ug of plasmid. Obsolete, no longer used, now superceded by thermocycle sequencing (see later)  Practical considerations for manual sequencing:  (i)  ssDNA?  Initially used M13 vectors, or PCR to generate ssDNA.  Now it’s routine to start  with d.s.DNA (plasmid or PCR product), and rapidly denature to get s.s. template. • pUC vectors: “Universal primers” (from lec03) Recall: “universal primers” for DNA sequencing: cloned insert sequences in pUC will be  different, but the adjacent vector sequences, next to the insert, will always be the same  à   prime DNA sequencing reactions (ii) primers: use “universal” primers,  ­Forward (F) and reverse (R) for pUC or pBS,  ­added options of T3 and T7  for pBS.    Or use specific primers vs. insert sequences.  pUC 18 Multiple Cloning Site Region Standard technology now is thermocycle DNA sequencing: use a thermostable DNA pol, and  do repeated rounds of DNA synthesis in a thermocycler—need much smaller amounts of  template e.g. 100ng or less, because the repeated rounds of synthesis generate enough  terminated fragments to see.  Most people just send their sequencing to commercial labs  which charge $5­10 per sequencing reaction. Other advantages: because you need less template, you can also get DNA sequence from much  larger pieces of DNA e.g. lambda clones.  Also, because you are using a higher temp, there  will be fewer problems caused by DNA secondary structure.  Automated Sequencing­added feature 4 different fluorescent ddNTPs, with unique spectra Can measure intensity at 4 wavelengths, to detect DNA products in a single lane on the  gel For automated sequencing, either the primer or the ddNTPs are labelled by incorporation of  a fluores­ cent dye. Thus, rather than running the gel for a finite time, and reading the result,  the machine uses a laser to read the fluorescence of the dye as the fragments pass a fixed  point. Much longer sequences can be read from each track in this way, because the separation  is not stopped at a specific point – instead, each fragment is allowed to proceed sequentially  to the bottom of the gel where the resolution is the greatest. A further advantage is that the sequence read by the machine is fed automatically into a  computer. This is not only much quicker than reading a gel manually and typing the resulting  sequence into a computer, but also avoids the errors that are virtually inescapable with  manual data entry. Maxam and Gilbert Chemical Sequencing • Almost never used any more (inconvenient chemistry). • The principle is the SAME as restriction mapping using partial digestion of end­labelled  DNA  1.  DNA labelled at one end only (like the restriction mapping applics). 2.  In separate tubes, chemically cleave the DNA at specific bases (like cutting with restr  enzyme) à but only partial cleavage  3.  Run on seq gel: the sizes of the bands in each lane represent increasing distances from the  labelled end  e.g. in the tube cleaved at A’s, if there are bands at n+1 and n+4, this means that there  are A’s in these positions in the sequence  Getting longer stretches of sequence? Sanger sequencingà typically only 500­1000bp per run.  How to sequence longer stretches of  DNA? (a) restriction digests and subcloning (b) primer “walking” (c) shotgun sequencing 5.1.3 Extending the sequence:  • the length of sequence that can be obtai
More Less

Related notes for MBB 308

Log In


Don't have an account?

Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.