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Department
Biology
Course
Biology 1001A
Professor
Tom Haffie
Semester
Winter

Description
Lecture 18 • Many mutational mechanisms are inherently involved in replication • DNA (information) is relatively stable and readily replicated • DNA replication­ anti­parallel complementary base pairing allows for accurate  relication (A­T G­C) • Replication is semi­discontinuous and semi­conservative • Prokaryotes have a single origin are replicate forks in either direction • Eukaryotes­ several origins • Organelle genomes replicate like prokaryotes • Both strands are replicated in the same replisome at the same time • DNA synthesis proceeds by adding an incoming nucleotide to the 3’ OH of a  properly paired base • 3’ OH has to be properly paired in order for DNA synthesis to proceed • Elongating the 3’ OH • To fill in a gap, you replicate 5’ to 3’ • You can only extend 3’ ends, only the one that has a free 3’ end • Helicases unwind the helix, primase makes RNA that are then extended by DNA  polymerase • Continuous synthesis on top strand, discontinuous on bottom strand, top strand is  leading, bottom is lagging • DNA unwinds further, and leading strand synthess proceeds continuously while a  new primer is synthesized on the lagging strand template and extended by DNA  polymerase • Another type of DNA polymerase removes the RNA primer, replacing it with  DNA, leaving a nick between the newly synthesized segments • Top strand is replicating continuously, bottom strand replicating discontinuously,  but both are following the same rules • Polymerases always read strands 3’ to 5’ • Replisomes replicate both strands at the same time • Both strands are replicated by the same replisome at the same time • Primer on the lagging strand is taken out by polymerase 1, and replaced as DNA • The first primer on the leading strand can be removed but in cannot be replaced,  there is no 3’OH to add bases on to replace this primer • Therefore, every time your DNA replicates it gets shorter Lecture 19­ Gene Mutation • No polymerases can extend from 5’ • The only strand that can be extended is one that has an available 3 end • Telomerase is an enzyme, kind of DNA polymerase, that helps elongate  chromosomes • Telomerase has its own built in template, length of RNA, provides the needed  template in order to make DNA extend the 3’ end • Repeats on the ends of chromosomes are called telomeres, they are repeats  because telomerase can only add DNA that is complementary to the template • Once telomerase fills in one length of sequence, it moves down and put it in again • Replication forks process both DNA strands • Elongation by DNA polymerase • Replisome replicates both strands in the same area • RNA primers don’t have primers, therefore primase doesn’t need a 3’ OH to add  bases to • RNA polymerases in general do not require a properly paired 3’ OH to add the  next base • DNA polymerases cannot start themselves • The first primer on the leading strand will be removed by DNA polymerases • Telomerase is a kind of DNA polymerase, makes DNA • All DNA polymerases require a template but filling the gap after primer removal,  there is no template • Telomerase has its own template, its own little bit of RNA that it uses as a  template to extend the 3’ end, and once it puts on one repeat, it just slides down  and adds another one • The reason telomeres are just repeats is because telomerase only knows how to  put in the sequence that is complementary to its template • Once it adds a repeat, it slides down and adds another repeat • When the 5’ end has been extended, it can be printed and replicated backwards • Telomerase does not prevent chromosomes from getting shorter, it just extends  them so they can shorten safely • Old cells have telomeres that have replicated many times, and the cell can tell  how old they are by how short they are • Telomeres are a way for cells to know how old they are, how many times they  have already divided, every time they divide, their telomere gets shorter, cells  need to know how old they are so they know to die (rather than gather mutations  and turn into tumor cells) • Telomerase is turned off most of the time in most cells • During gametogenesis, telomerase extends the chromosomes, and as you get  older, they can only lengthen the telomeres to a point • When the telomeres get very old, they get very short, so the cell will kill them • Telomerase is often expressed in tumor cells • Telomeres need to be on chromosomes before they are given to babies, need cells  that are going to divide a number of times • Most cells are not expressing telomerase because we want the chromosomes to  get shorter • The Ames test is used to find out what things in the environment caused mutations • Uses salmonella bacteria and the bacteria are mutants at the beginning of the test  (his­) cannot make their own histodine, so when you plate them on minimal  medium, they will die • It puts different chemicals on bacteria and sees if it causes cancer • The bacteria that they use in the test were His­ salmonella, that could not survive  on minimal medium • Except, there are some that do survive­ those ones that do are revertants­ it means  normal/wild type • Reversion means going from mutant to wild type­ this is a mutation • Some of these cells can revert to a normal genotype, this is a mutation • Really easy to find the revertants in this test because they are the only ones that  will grow • The Ames test is based on reversion, the colonies that are growing on the plate are  wild type, they have reverted back to normal • When you put a mutagen on the disk, it dramatically increases the frequency of  mutation in the bacterial strain • A mutation is a heritable change in the double stranded DNA sequence  • Common types of change in the DNA sequence: 1) base substitutions 2)  insertion/deletion/ reorganization  • The distributions of electron throughout a whole molecule isn’t necessarily stable,  it can shift • Spontaneous tautomeric shifts change base pairing rules • However, this shift doesn’t happen very often • AGTC are relatively tautomerically stable • There are no mechanisms to fix it if it does happen • Mutations are double stranded, when there is a mistake in a single strand, its not a  mutation • If you have an A­G where you should have an A­T, that’s not a mutation its  damage, but when you have a G­C when you should have an A­T, that’s a  mutation • The damage gives rise to a mutation • DNA replication is inherently mutagenic • Some mutagens are tautomerically unstable base “analogues” • Example­ mutagen called 5br • Bromouracil is indistinguishable from thymine • Therefore it is extremely toxic because cells cannot distinguish it from the methyl,  and they put Bromouracil into your DNA instead of thymine • 5Bu is a base analogue • When there’s a methyl group on thymine, it is quite stable, but when bromine is  there, it is tautomerically unstable so bromine gets put in your DNA as thymine  but then it is continuously switching, bringing the wrong bases in, causing  mutations • The effect of a substitution mutation depends on codons­ is it in a coding region  of the genome? If it is, then it does matter • Silent mutations­ do not effect amino acid, changed codon specifies the same  amino acid (because the genetic code is redundant) • Missense mutations­ changed codon specifies changed amino acid­ may or may  not have dramatic changes on the phenotype • But missense mutations can also be mild and may not effect protein that much • Nonsense mutations­ changed codon specifies a stop­ codes for a stop codon and  then there is premature termination of the polypeptide Lecture 20 • Telomerase is active on both ends of a chromosome • Primase, DNA polymerase, polyA polymerase all can extend a 3’OH on RNA • In general, in/del mutations tend to be sequence specific • In/del mutations are when insertion and deletion mutations happen at the same  time on complementary template strands • When insertion happens on the newly synthesized strand, deletion will happen on  the template strand • Will often happen at a long strand of the same base (long string of T’s), one slips  up and then an extra T will get inserted • Huntington’s can be a result of an in/del mutation • Indel mutations shift the reading frame downstream, changes the entire reading  frame for translation  • If you used to read CATCATCAT but an insertion or deletion happens, you end up  reading ATCATCATC  • If a prokaryotic gene suffers a deletion of a single base pair in the coding region  (resulting in a frameshift during translation) what will happen when the ribosome  gets to the stop codon? • It will “read through” the stop codon, and continue until it gets to a new stop  codon, and if a new one wasn’t made then it will continue right to the end, will  translate the poly­A tail • How many reading frames are there? • 3 different frames • No cell uses all the frames at the same time but the information capacity is there • Theoretically cells could code 6 genes in the same stretch of double stranded  DNA • What would happen if a single base insertion mutation occurred in the DNA of the  first exon of a hemoglobin gene? A longer pre­mRNA would result • Splicing is very precise because the snrps pair with the splice signals between  introns and exons but snrps do not understand the genetic code or reading frames,  so if the sequence they are binding on to is one pair more or less, the snrps don’t  care­ so putting a base pair into a gene does not mess up the splicing • What about mutations that affect DNA outside of coding regions? • Proofreading is the ability of polymerase to be an exonuclease, has the ability to  degrade DNA • DNA is called polymerase because that’s mostly what it does, it polymerizes  DNA, but it also has the ability to be an exonuclease, to degrade DNA • Polymerase 1 degrades RNA • Putting in the wrong base during replication is not a mutation its damage • At the bottom of the picture you can see that a C has been paired with an A,  damage • The C is distorted, but it has a 3’OH on the end of it, waiting to receive the next  base • But the 3’OH is not in the right place because you need a 3’OH on the properly  paired base (C is not the properly paired base) so elongation will stop • Polymerases proofread­ they back up and take out the mismatched base   • RNA polymerases cant do this­ do not require the 3’OH to be on a properly paired  base, that’s why they can start polymerization  • Reverse transcriptase make a lot of mistakes because they cant proofread • DNA polymerases are not perfect, mismatches can persist • If a mismatch persists, then it can be repaired by excision repair­ base is removed  and replaced properly and the mismatch can be repaired • *Cannot repair mutations, only damage • Mobile elements can be very active in plants, sometimes the mobile element goes  in, sometimes in comes out­ that is what causes different colours and streaking in  flowers and Indian corn • Mutagens are not just nasty chemicals, there are a lot of biological mutagens • Mutagens can be chemical, biological, or physical • 5Br is a chemical mutagen, iap (aguti gene in mice) is a biological mutagen, UV  rays are physical mutagens • UV radiation causes thymine dimers that distort the helix • There a covalent bonds between adjacent thymines­ dimers­ this is because of UV  rays • Thymine dimers are damage, not mutations, but they distort the helix, can block  replication and transcription • Cells needed to evolve ways to deal with dimers caused by UV • Dimers can be repaired by photolyase­ driven by the energy of white light­  restores the damage­ breaks the bonds of the dimer • However humans don’t have this­ bacteria and some plants have this • Dimers can also be repaired by excision­ cutting out the damaged areas­ replace  the gap in the same way that a primer would be replaced, very active in human  cells • If you are born with low excision repair, then you have a very high predisposition  for skin cancer and you need to stay out of the sun • Chernobyl (April 1986): • Nuclear accident occurred in Chernobyl­ radioactivity spewed all over eastern  Europe­ caesium 137­ heavy molecule • Failed safety test led to explosions and fires, releasing radioactive material into  the atmosphere • Exposure spread out to quite far regions, the danger of it lessened as you got more  and more far away • Radioactivity is a characteristic of unstable isotopes­ decay over time • Decay of carbon over time is not particularly dangerous, but decay of other atoms  (caesium and iodine) is, it creates reactive oxygen  • Decay of radioactive iodine and cesium creates ionizing radation, when the high  energy particles pass through your cells it creates reactive oxygen • Iodine has a relatively short half life, cesium relatively long • Iodine is concentrated in thyroid glands • When there is to much exposure to iodine on a population, you have to flood your  system with cold iodine to counteract the hot iodine in your thyroids • What are the effects of radiation exposure on a large population? • Birth defects­ Down syndrome incidence spiked in Belarus 9 months after  exposure • This does not necessarily prove radiation exposure is what caused it because there  are other spikes that do not have to do with radioactivity • Maybe the reactive oxygen is interfering with the spindle of the egg cells in  women such that when the come out of meiotic arrest at fertilization maybe  there’s a problem with segregation of chromosomes at meiosis one or two so  maybe you get gametes that are unbalanced, and led to increases in trisomes • ROS can cause breaks in DNA helix, resulting in rearrangements (deletion,  duplication, inversion) Lecture 21: Immunogenetics • Immunology is a great example of mutations that you do on purpose • You mutate your DNA on purpose as part of your immune system • Most radiation exposure is “natural”, radioactivity is part of the natural word and  your DNA suffers damage as a result • Mutagens in the natural environment can have consequences • Many cases of trisome 21 happen just because of background radiation • Effects of radioactivity­ increase in thyroid cancer (because radioactive iodine is  concentrated in thyroids) • Epidemiology is the study of the incidences of disease • However, this jump is a doubling, but in Belarus at that time, the health care  system wasn’t that good so maybe the increase in thyroid cancer is just an  increase in detection because people were looking more carefully after the  disaster • Reactive oxygen can cause breaks in DNA helix (double stranded breaks),  resulting in rearrangements:     • Cells have repair mechanisms to try to put chromosomes back together that have  been broken • You cant detect substitutions that are wrong (AT pairs where it should be GC), but  a broken chromosome can be detected and possibly fixed • When fixing it, mistakes can occur such as­ insertion, deletion, inversion, or  translocation • Chromosomal rearrangements are results from your cells attempt to repair breaks  in double stranded chromosomes • A particular type of translocation­ piece of 8 being swapped for a piece of 14, can  result in Burkitt Lymphoma: fusion of oncogene and strong promoter • Translocation brings a chunk of MYC (an oncogene) under the control of  antibody genes (on chromosome 14) • Antibody genes are very powerful promoters and when they control MYC, cancer  results • Blood and lymph cells all arise from hematopoietic stem cells in bone marrow • Part of the immune system is innate, shared with other lower life forms,  invertebrates and plants have it too, essentially non specific, innate immune  system goes after anything that goes through the skin barrier, and by  phagocytosis, gobbles up any antigens that may infect the cell • Cytokines and chemokines are chemical messenger proteins used for the cells to  communicate with each other to attract other cells to the site of th injury • Histamine increases the permeability of capillaries, allowing these immune cells  to get out of blood vessels at the site of injury • No antibodies involved in the innate immune system • Innate immune system has no memory • The adaptive immune system is specific and does have memory • Within adaptive there are 2 categories: cell based, and antibody based (a way to  distinguish the two is by what is doing the killing) • Cell mediated immune response­  • When a cell is infected with a virus, that cell can break up the virus (using the  lysosomes and proteasomes) and by this system, the bits of virus end up displayed  on the surface of an infected cell • A T­cell recognizes that particular antigen and that stimulates those T­cells to  become activated and divide like crazy • The T­cells then go looking for other virus infected cells, and they kill them • The T­cells kill the viruses by producing perforins that poke whole in the cells  infected with the virus, and they die • Antibody based immune system­ Antigen Presenting Cell▯ • Dendritic cells are highly mobile and are looking for non self cells and when they  find one they engulf it by phagocytosis and display their antigens on the surface • This is then called an antigen presenting cell (APC) • This cell then travels to lymph nodes where it shows these antigens to T4 cells • Each T cell has a different and specific receptor • Once the correct T cell recognizes the antigen, it gets activated, chemical  messenger proteins that stimulate the T cell to divide activates, and the T cell  divides like crazy • These T cells (helper T cells) now go out looking for B cells  • They help B cells to respond to the same threat • The B cells then get activated and divide like crazy, they can only do this if they  associate with a helper T cell • If there is just one bacterium in one place in your body, you don’t need an  immune response in your body, the B cells don’t do anything unless there is also a  T cell that recognizes the same antigen • One type of B cells pump out massive amounts of antibodies against the particular  antigen • Each B cell has a receptor (BCR) on it that recognizes one particular antigen, but  there are many thousands of B cells in our bodies  • Other B cells differentiate into memory cells, these memory cells that are long  lived • Plasma cells are not very long lived because you need to be able to close it down • All the antibodies that are dumped into your blood stream start binding onto  antigens, or make agglutinate (an insoluble clump):   • This is what targets cells for killing­ antibody mediated arm of immune system • The memory cells are responsible for a much more robust immune response the  second time you are exposed to a particular antigen • Vaccination­ exposing immune system to some non dangerous version of the virus  that’s enough to elicit immune response so that the next time you encounter the  virus there will be a much stronger response (creates memory cells) • This is why a lot of RNA viruses are replicated by RNAses, that do not proofread,  therefore the make a lot of mistakes­ but that’s what the flu virus wants so that the  antigens are constantly changing and the hosts cannot anticipate that infection the  second time • Arms race between pathogens and the immune system • Cancerous tumors directly hide from the immune syste, and when killer T cells  come after them, the tumor cells kill them! • Antigen­binding receptors on B cells and T cells: • B cell receptor can be converted into antibody, looks the same as an antibody,  stuck in the membrane right now but once they get activated this kind of protein is  dumped out into the bloodstream • How is it that you only have 25 thousand genes but make millions of immune  system proteins? • How does a B cell choose the receptor protein that it’s going to display? (because  each one has a unique receptor) • There are 2 heavy chains and two light chains that make up this protein • On the chromosome there are segments called V (variable) (100s) and J (joining)   (4 or 5) and as the B cell matures, it purposely causes mutations in order to build a  gene • You make immunoglobulin receptor genes yourself, from the segments (“Lego”)  you get from your mom and dad • The intervening DNA loops out and is cut (this is not splicing, this is at the level  of DNA) then the mRNA is spliced • In the end, one V and one J is chosen and they are brought close together to make  the light chains • After translation, the light chains of that receptor are created • As a zygote you did not have the genes for making light chains on your  antibodies, you make the genes yourself • This process is called somatic recombination­ happens in somatic cells, not in  meiotic cells • DNA is being recombined to build a new gene • When creating the heavy chain­ something similar happens but now there are not  just V’s and J’s but also D’s (diversity) • Random combinations of these segments are created to produce unique heavy  chain receptors • That’s how there are so many combinations possible making millions of receptor  possibilities • This reorganizing can sometimes make a mistake and you can end up with  antibody genes driving oncogenes • Why doesn’t the immune system of the goat go after the sheep? How can they  combine to make a “geep”? (Semester 2­ chirality) Lecture 22­ DNA Technologies 1 • DNA technologies in reference to the Elysia Vaucheria system • Elysia has mitochondria and chloroplasts • Most of the proteins required for the organelle to work are coded in the nucleus • Elysia can maintain chloroplasts from Vaucheria for a very long time • Perhaps the genes that encode the chloroplast transfer from the nucleus of  Vaucheria to the nucleus of Elysia • The question is, did ancestors of modern day Elysia pick up some of the nuclear  genes of Vaucheria that encode the chloroplast Horizontal Gene Transfer: • Paper provides evidence that horizontal gene transfer (aka lateral gene transfer)  from one organism to another • Vertical gene transfer is parent to offspring • Evidence in the Elysia nuclear genome of a gene that was in Vaucheria nuclear  genome, specifically psbO PsbO encodes a component of PS2: • Gene resides in the nucleus • Encodes a component of the oxygen evolving complex • When water is split and oxygen released, psbO is part of that complex • Manganese stabilizing protein • Paper suggests that the Elyisa nucleus has a copy of the gene that would encode  for that protein Expression of psbO in Elyisa: • Agarose gel electrophoresis • Amplified a portion of psbO transcript­ looking at the abundance of the message  in the cytosol • After its transcribed and its sitting in the cytosol waiting to be translated, that’s  what being picked up • Vaucheria has a lot of psbO transcript, but you wouldn’t expect to find it in Elysia • The Elysia lane is 5 months after feeding Vaucheria, so you would never expect  the transcript to be there if it actually came from Vaucheria particles as a result of  feeding • Therefore, this suggests that this transcript is from a gene that Elysia actually has  and is actively transcribing • Band is a 452 bp fragment • If you would actually take Elysia and load the transcript on a gel, you wouldn’t be  able to detect this, this result is amplification of the psbO gene Polymerase Chain Reaction (PCR): • Method to amplify portions of genes and DNA • PCR is extremely powerful, transformed biology • Invented by Kary Mullis, Nobel prize in 1993 • Amplification of DNA in a test tube • Used for forensic science, phylogenetic studies, disease testing, gene studies • Have to know how PCR works! How it works: • Uses repeated cycles of heating and cooling to make a copy of a specific region of  DNA • First the temperature is raised to near boiling, causing the double stranded DNA to  separate, or denature into single strands • When the temperature is decreased, primers bind to complementary matches on  the target DNA sequence • The primers bracket the target sequence to be copied • At a slightly higher temperature, the enzyme taq Polymerase binds to the primed  sequences and adds nucleotides to extend the second strand • This completes cycle 1 • In subsequent cycles, the process of denaturing, annealing, and extending are  repeated to make additional DNA copies • After 3 cycles, the target sequence defined by the primers begins to accumulate • After 30 cycles, as many as a billon copies of the target sequence are produced  from a single starting molecule • The high temperature breaks the hydrogen bonds that are holding the strands  together • Required because specific primers need to anneal through complementary base  pairing • Primers are short, 16­25 bp long, complements of a specific region on each strand • Lowering the temperature enables them to anneal • It takes about 30 seconds to allow annealing to take place • Then raise the temperature back up to allow polymerization, the extension in the  3’ direction to occur • This is important because if you can amplify a piece of DNA you can see it on a  gel, and separate it out from the rest of all the transcripts Components for PCR: • DNA template: 100­500 ng of DNA­ very low amount of DNA, if you ran it on a  gel you'd see nothing • Two primers (DNA oligonucleotides) • Every cycle requires two new primers­ millions molecules of each type of primer • Deoxynucleotides­ dATP, dTTP, dCTP, dGTP • The main component is the DNA polymerase, isolated from a thermophilic  bacteria, likes to grow at high temperatures­ taq polymerase, isolated from the  bacterium thermos aquaticus, very thermostable­ needs to be able to deal with 94  degree temperatures at every cycle  • Taq polymerase has an extension rate of 1000 nucleotides per minute, and en error  rate of 1/9000 bases­ lacks exonuclease proofreading ability PCR is based on specificity: • PCR is based on specificity of primer binding, couldn’t amplify the gene if  primers weren’t specific • In any given DNA sequence: 1 in 4 chance of finding an A, G, T, or C, 1 in 16  chance of finding any dinucleotide sequence, 1 in 256 chance of finding a given  4­ base sequence, 1 in 4^16 chance of finding a given 16­base sequence • If longer than 16, the RNA molecule starts to interact with itself • Cannot be shorter than 16 bp, because it would lack specificty Making primers for an unknown sequence? • How to determine the sequence of psbO in Vaucheria in order to make primers? • Use known psbO sequences deposited at National Centre for Biotechnology  Information (NCBI)­ almost 300 known psbO sequences, but how do we know  those are in fact psbO? • First sequences obtained by isolating and sequencing the protein • Because of degeneracy of genetic code­ you cant get the perfect sequence for  psbO protein but you can get an idea of it • Can also get the sequence by studying mutants of cyanobacteria • Of what use is having psbO from another system? How does this help us figure  out its sequence in Vaucheria? • They are similar because these sequences are homologous­ share common 
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