Study Guides (238,207)
Canada (115,009)
Biology (1,419)

Cell Biology 2382 Notes - Cummings (First Midterm)

66 Pages
Unlock Document

Western University
Biology 2382B
Robert Cumming

Introduction to Cell Biology Samuel Tobias What is cell biology? Cell Biology is an academic discipline that studies cells, the basic structural, functional and biological unit of  all known organisms.  Cell biologists look at all aspects of the cell: cell structure cell organelles and membrane trafficking cell cycle, division and death cell movement cell signaling cell communication What is a cell? Ultimate goal is to understand how macromolecular systems and organelles work and cooperate to enable  cells to function autonomously or as tissues. How do we study cells? Hypothesis­Driven Experiments Know the tools and methods to isolate and maintain cells in vitro to know what we’re looking for how to separate organelles identify and study how proteins drive a cell’s biological processes. Once we have the tools, we can start to ask and answer questions about our ~75 trillion cells in our body. Cell Culture Cell culture is the technique used to grow cells or tissues outside the organism under strictly controlled  conditions. 2 Much easier to grow single cell organisms than animal cells, because they come from multicellular  organisms. Cells isolated from any tissue by breaking down the cell­cell cell­matrix interactions. (mechanical  fragmentation, trypsin, EDTA) Trypsin chews apart extra­cellular matrix turns a clump of cells into individual cells EDTA reacts with Calcium ions, which make the outside of the cell sticky.  Cells are supplied with proper nutrients (amino acids, minerals, vitamins, salts, glucose, etc) and serum  (insulin, growth factors) and grown usually at 37°C in a CO in2 bator. (Body conditions) Serum is the liquid component of blood lacking in cells contains insulin (for uptake of glucose) growth factors stimulate cell growth Medium in which cells are grown is red because phenol red indicator is used. Indicates pH, and therefore  cellular activity Cells can grow as adherent cell cultures or suspension cell cultures. Adherence cells are stuck to the bottom of the vessel Suspension cell flasks have a spinner to prevent adherence to the sides of the container. Primary cell culture refers to cells taken directly from an organism. These cells usually divide a limited  number of times (~50 generations, Hayflick limit). Also undergo contact inhibition. Confluent monolayer one­cell thick they’re densely packed, cannot move around. When exposed to trypsin, the monolayer falls apart, and the process can be started again.  Contact Inhibition cells get close, they stop dividing Cell line refers to cells which are transformed and are able to grow indefinitely. Also known as immortal  cells. Less likely to exhibit contact inhibition. HeLa cells come from cervical carcinoma of Henrietta Lacks instrumental in forming vaccines, etc 3 immortal Birth, Lineage, and Death of Cells Stem cells can make more exact copies of themselves Cell differentiation is when cell takes on different attributes/properties than a stem cell typically have a finite life cycle As seen in the diagram ▯ Stem cell can either differentiate or self renew Embryonic Stem Cells (ES cells) can be maintained in culture and can form differentiated cell types. 4 Feeder cells secrete factors that help inner cell mass cells grow These ES cells differentiate very easily very hard to keep in undifferentiated state In suspension, ES cells form embryoid bodies Embryoid bodies give rise to all  3 germ layers of embryo: endoderm, mesoderm, ectoderm ES cells can be induced to differentiate into precursors for various cell types can be grown indefinitely under right conditions, and are pluripotent Adult Stem Cells Most tissues contain adult stem cells Adult stem cells are required to maintain and repair tissue Capable of generating a limited number of different cell types 5 Adult stem cells are located in the stem cell niche (adjacent cells provide signals to either self renew of  differentiate). Is the path a one way trip? We CAN take differentiated cells and return them back to stem cells Insert genes that code for  transcription factors turn back time to ES cell state Called “induced pluripotent cells” iPS cells future of transplantation medicine Origins of Cancer Genetic mutations can arise that result in uncontrolled cell division or prevent programmed cell death (apoptosis) These mutations can occur in Stem Cells or Normal Cells Reprogramming Normal Cells to Stem cells could  potentially promote the  Cancer cells may arise from proliferating normal cells and also from stem cells Remember: Stem cells have no specific function, other than to differentiate into other cells. Imaging in Cell Biology Samuel Tobias Anton van Leeuwenhoek Imaging in Cell Biology Samuel Tobias Built many simple, single lens microscopes First to observe living protozoa and bacteria, which he called “animalcules”  Went on to visualize human red blood cells and sperm With great skill at grinding lenses, naturally acute eyesight and lots of patience, he was able to achieve  magnification of 200X Features of a Modern Compound Microscope (“Bright­Field”) light source condenser to focus light on specimen objective lens to collect light after it has passed through specimen ocular or eyepiece lens to focus imagine onto eye typical light microscope magnification is 40­1000X only structures with high refractive index (ability to bed light) are observable Darker structures bend or slow down light more (higher refractive index) Resolution of Microscopes Resolution: the ability to distinguish between two very closely positioned objects as separate entities A conventional microscope can never resolve objects/cellular features that are less than ~0.2µM apart Smaller resolution is better Making numerator small or denominator bigger▯ resolution gets better Imaging in Cell Biology Samuel Tobias Lens getting closer to specimen increases a Obtaining contrast in light microscopy: Exploit changes in the phase of light Certain parts of the cell (eg. nucleus) refract light more than other parts Cellular constituents with high refractive  properties can slow the passage of light by a quarter wavelength (~1/4λ) Phase Contrast Microcopy used to examine live ‘unstained’ cells small differences in refractive index & thickness within the cell are further exploited and converted into contrast visible to the eye.   Differential Interference Contrast Microscopy (Normarski Microscopy)  used to examine live ‘unstained’ cells small differences in refractive index & thickness within the cell are converted into contrast visible to the eye. uses polarized light DIC microscope is equipped with polarizers Imaging in Cell Biology Samuel Tobias Defines the outline of large organelles such as nucleus and vacuole, and provides better detail of cell edge. Good for imagine live cells shows 3D topographical features                  Bright­field                 Phase Contrast                     DIC note the Phase Contrast ‘halo’ around the outside of the cell Fluorescence Microscopy Uses a property of certain molecules to fluoresce, i.e. to emit visible light, when they absorb light at a  specific wavelength. (eg. invible UV light) Location of fluorescent dyes or fluorescent protein molecules can be imaged.  Can visualize more than one protein or cell structure  we can do multiple types of labelling to discern different structures, proteins, organelles, etc. Dyes, or “fluorophores” absorb energy kicking electrons (e ) into a higher orbital. ­ Instability causes e to drop into its normal orbital, releasing energy as visible light. “Fluorescence.”  Imaging in Cell Biology Samuel Tobias Stoke Shift is the difference between the optima of excitation and emission. How are fluorescence images obtained? Light doesn’t pass through the specimen, Imaging in Cell Biology Samuel Tobias it is reflected off  Dichroic mirrors reflect most light, but let specific wavelengths pass through The many colours of flurophores signals are bright on a black background A variety of fluorophores exist with different excitation and emission wavelengths, that allow labelling of  more than one protein or organelle at the same time. DAPI binds to DNA, emits blue Mitotracker Red shows mitochondria, emits red. A dye can be conjugated with antibodies to localize molecules of your interest in cells (immunofluoroescent  staining) Monoclonal Antibodies B­cells in mouse, recognize synthetic protein (antigen) as foreign, and produce antibodies Find these antigens in spleen cells, and fuse these cells Imaging in Cell Biology Samuel Tobias with mutant mouse myeloma cells Fusing the immortal myeloma cells with mouse spleen  cells, will hopefully cause cell to be immortal, and continue to produce the antigen HAT medium only lets the fused cells survive. therefore, after culturing the cells in HAT medium, we get a pure population of immortal ‘Hybrid’ cells that  produce the antigen. Immunofluroescence Microcopy Antibodies are made to specific proteins (eg. microtubules, actin) Antibodies are added to cells fixed on a slide which bind the specific protein they were designed to recognize “Primary Antibodies” Secondary antibodies with attached fluorophores are added and bind to the primary antibodies Each fluorophore has a unique excitation and emission wavelength that can be detected with appropriate filters in the microscope. Use appropriate microscope filter set for each fluorochrome Imaging in Cell Biology Samuel Tobias then digitally overlay images Note: immunofluoroescence microscopy is performed on  fixed cells (ie. dead) Fluorescent imaging in live cells: Green Fluorescent Protein (GFP) Derived from a naturally occuring protein found in a jellyfish capable of bioluminescence.  The protein containsa short sequence of amino acids (chromophore) that are capable of fluorescing when  excited with blue light. Gene was isolated and heavily modified so it would encode a protein with properties ideally suited for live  cell fluorescent imaging.  GFP­Fusion Proteins allow fluorescent imaging in live cells. plasmid DNA needs to be transfected into the DNA of a cell. Fluorescent proteins come in many different flavours! Imaging in Cell Biology Samuel Tobias By mutating various amino acids in GFP, new types of fluorescent proteins were created with different  excitation and emission profiles Two or more different fluorescent fusion proteins can now be visualized in live cells Laser Scanning Confocal Microscope Gives very good resolution, and can comine layers to produce 3D reconstructions of cells. Laser uses a very precises wavelength of light focuses at a very small point at a certain point in the cell Fluorescence microscopy is extremely powerful due to its ability to show specifically labeled structures  within a complex environment and also because of its inherent ability to provide three­dimensional  information of biological structures. However, this information is blurred by the fact that, upon illumination, all fluorescently labeled structures  emit light no matter whether they are in focus or not. This means that an image of a certain structure is  always blurred by the contribution of light from structures that are out of focus. Imaging in Cell Biology Samuel Tobias Confocal microscopy generates the image in a completely different way to normal "wide­field" microscopes.  Using a scanning point of light instead of full sample illumination confocal microscopy gives slightly higher  resolution, and significant improvements in optical sectioning by blocking the influence of out­of­focus light  that would otherwise degrade the image by means of specific pinhole, which is located in front of the  detector. Confocal microscopes use laser as the source of illumination. Laser scans the sample within the  focal plane. Confocal microscopy can be used where 3D structure is important.  Deconvolution Microscopy A computationally intensive math procedure to remove fluorescence contributed from out­of­focus parts of  the stained sample It considers so­called point spread function which determines the degree of blurriness by comparison to a  reference set of tiny fluorescent beads Images are taken at different focal planes (called a Z­stack) Images restored by deconvolution display impressive details without any blurring. Basically, images are taken at different layers throughout the cell, and computationally, light from other  layers which would be seen as blurry is removed from the layer you are focussing on. (Making a dirty image  clean, by digitally subracting out the blurry stuff. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) to measure protein interactions in live cells If no protein interaction occurs then excitation of cyan fluorescent protein (CFP) will only result in cyan  fluorescence (480 nm) If protein interaction occurs then excitation of CFP will result in yellow fluorescence (535 nm) In picture, protein interaction detected at front of migrating cell If the proteins do not interact, we will only see the blue If the proteins do happen to interact,  then we will see yellow fluorescence  Imaging in Cell Biology Samuel Tobias From Fluorescence to Electron Microscopy  EM provides better resolution than FM. EM, however, needs fixed and sectioned samples or metal­coated samples, i.e. living cells cannot be  imaged.   Electron Microscopy Essentials  1. ­wire filament is an electron source & when it’s heated, electrons accelerate towards anode 2. ­a magnetic (not glass) condenser focuses electrons on specimen 3. ­specimen is stained with electron­dense heavy metals (lead, uranium, osmium tetroxide) Has to be done in a vacuum. Doesn’t use glass as a lens, uses magnets to focus beam on specimen The fundamental principles of EM are similar  to those of light microscopy; the major difference  is that electromagnetic lenses focus a  high­velocity electron beam instead of visible light used by optical lenses.  In a transmission electron microscope (TEM), images are formed from electrons that pass  through a specimen. Electrons are emitted from a filament and accelerated in an electric field.  Imaging in Cell Biology Samuel Tobias A condenser lens focuses the electron beam on  the sample; objective and projector lenses focus  the electrons that pass through the specimen and  project them onto a viewing screen or other detector. In a scanning electron microscope (SEM), images  are formed from electrons that are scattered  from a metal­coated specimen. To coat samples such heavy metals as platinum and gold are used. SEM  produces images that appear to be three­dimensional.  Images are formed from electrons that pass through a specimen (TEM) or are scattered (SEM) from a  metal coated specimen TEM intracellular structure  SEM outside of cell structure Important that entire tube in both TEM and SEM is maintained under an ultrahigh vacuum because atoms  in air would absorb electrons. Resolution of a TEM Very fine D No N, as light is replaced by electrons in a vacuum sin a is now a since electron scatter is ~0 Theoretical resolution is 0.005nm; the effective resolution is 0.1nm 2000X greater than light microscopy Sample Preparation for TEM Imaging in Cell Biology Samuel Tobias Fix cells, then embed in plastic, then make sections with an apparatus Take the sections, stain with heavy metal How is imaged formed? electrons hit specimen but deflect due to metals deposited on organelles unobstructed electrons are focused by lenses onto a phosphorescent screen crystals in the screen, excited by the electrons, give off energy as visible light B&W image is made up of shadows where electrons failed to penetrate 4. Areas that take up less stain appear lighter. Detection of specific proteins using immunoelectron miscroscopy Antibodies recognized a specific protein, called an antigen Antibody can be linked with a heavy metal (gold) with another protein Wherever the antigen is inside the cell, the gold particle is bound to it, therefore showing dark dots where  the protein are. Isolation and Analysis of Organelles and Molecules Samuel Tobias Labelling live cells with fluorescent antibodies or stains Antibodies made against specific cell surface proteins can be linked to fluorophores Membrane permeable fluorescent dyes can be used to label intracellular structures (i.e. Hoechst stain binds  DNA in nucleus) Cells with bound antibodies or that have taken up the dyes can now be sorted and counted  Isolation and Analysis of Organelles and Molecules Samuel Tobias Cell Cycle Analysis by FACS Cells that have replicated their DNA but not fully divided (G2) will have twice the Hoechst stain fluorescence  intensity of non­dividing cells (G1) Quantifying number of cells in each stage of the cell cycle ▯ All eukaryotic cells contain membrane­limited  compartments termed organelles.  The isolation of organelles based on  their  different density and different sizes.  Among cell organelles, the nucleus,  mitochondrian, and chloroplast are bounded by two bilayer membranes. All other  organelles are surrounded by single membrane. How do we isolate Cell Organelles? Isolation and Analysis of Organelles and Molecules Samuel Tobias STEP ONE: DISRUPTION of CELL PLASMA MEMBRANE i) mechanical homogenization ii) sonication  (ultrasound) iii) pressure (cells are forced through a very narrow valve) iv) non­ionic detergents i.e.,  Triton X­100 v) placing cells in hypotonic solution STEP TWO: CENTRIFUGATION of CELL HOMOGENATE i) differential   ii) equilibrium density­gradient Safe centrifugation requires balanced loading of the centrifuge rotor. Imbalanced rotors can lead to damage  to centrifuge and rotors.  Differential centrifugation is a common first step in fractionating of a cell homogenate.  Differential centrifugations means  centrifuging a homogenate at different  speeds and times.  Cell organelles which differ in size and  mass travel to the bottom of the  centrifuge tube (undergo sedimentation) Isolation and Analysis of Organelles and Molecules Samuel Tobias  at different rates.  spinning homogenate yields  pellet & supernatant increasing centrifugal force (gravity)  to isolate organelles based on mass Equilibrium Density­Gradient Centrifugation Further separation of organelles based on density separation based on density homogenate is applied to a gradient of sucrose at high speed/several hours, organelles migrate to sucrose layer equal their own density and remain there How are proteins separated from the organelle? Amphipathic Detergents have a hydrophobic end and a hydrophilic end hydrophobic part is good at disrupting lipid bilayers Triton X is a little weaker, leaves Transmembrane protein together SDS breaks apart protein interactions Isolation and Analysis of Organelles and Molecules Samuel Tobias SDS­PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) Electrophoretic separation of proteins is most commonly performed in polyacrylamide gels and called  polyacrylamide gel electrophoresis  PAGE is usually  carried out in the presence of the negatively charged detergent SDS and called SDS­ PAGE. SDS is denaturing and binds to and destabilizes the hydrophobic side chains within the core of proteins All polypeptide chains are forced into extended negatively charged conformations with a similar charge­to­ mass ratio. The mobility of the SDS­protein complexes are influenced primarily by molecular size, i.e MW=daltons How do we quantify the actual proteins? Two types of stains: Coomassie Brilliant Blue Silver Relative mobilty is proportional to size small proteins move fast How to detect a specific protein? Apply an electric current to gel, and the proteins are transferred to the membrane, which makes them more accessible to antibodies Put membrane in an antibody solution and shake,  leave time for antibodies to bind to protein of choice Isolation and Analysis of Organelles and Molecules Samuel Tobias Then, use secondary antibody, linked to an enzyme, that binds to the primary antibody. After an enhanced  chemiluminscent substrate reacts with the enzyme, the secondary antibody will glow. Then, after placing an x­ray film on it, we have a permanent version of the blot. We can detect the bands using the luminescent procedure, and the degree of darkness is proportionate to  the amount of protein that the antibody detected Bigger band = more protein expression Protein Synthesis and Transport Samuel Tobias Protein Sorting and Targeting Typical mammalian cell: 10,000 proteins Must be localized correctly Newly made peptides must be directed to the correct destination Targeting: Directing proteins to the right destinations (organelles) During or after synthesis Sorting Direct proteins to the secretory pathway (ER, Golgi, lysosomes). General Principles of Protein Synthesis, Targeting and Storing Many proteins are synthesized just by cytosolic ribosomes: Those which remain in the cytosol Those which are targeted to intracellular organelles such as (ER), mitochondria, chloroplasts,  peroxisomes, and nucleus (they have a specific signal sequence) typically found at amino end of peptide can be found elsewhere in peptide, however Other proteins are synthesized by ribosomes attached to ER (the rough ER): Those which reside  in ER and proteins  which are sorted to  Plasma Membrane (PM),Golgi complex, and lysosomes. Protein Synthesis and Transport Samuel Tobias Accordingly, two major  protein­sorting pathways  are known: nonsecretory  and secretory. Some proteins are fully made in the cytosol, then directed into an organelle Some proteins are made and imported at the same time as it being translate at the ER Proteins use a translocation channel (a pore) that allows a protein to get through a membrane Endoplasmic Reticulum Structure First part of it is a direct continuation of nuclear membrane uninterrupted membranous tubules & vesicles separated from cytoplasm (cisternae) stacked on eachother RER has ribosomes on cisternae Stringing Concepts Together! identify cellular features by microscopy, isolate & homogenize them to free organelles sucrose density­gradient centrifugation of homogenate allows for isolation of microsomes & ribosomes microsome is small part of ERM that has broken off and refromed on itself functional because still associated with ribosome SDS­PAGE is used to identify newly translated proteins Protein Synthesis and Transport Samuel Tobias After separating/purifying with sucrose, split that amount into 2. half treat with detergent, exposing proteins found within the microsome to an added protease. protease will chew up all protein Other half, no detergent, add protease will eat up proteins outside the microsomes,  however leaving the internal proteins unharmed This reveals that the ER is where proteins are secreted are  incorporated have to go through ER Endoplasmic Reticulum Functions Secreted & membrane proteins are sorted through the RER Sugars/carbohydrates are added to the polypeptide disulphide bonds are formed proteins are folded by chaperones these are all post­translational modifications Translocation and Translation Occur Simultaneously If you make a protein outside of the ER, it won’t go inside But if you mix all the stuff at the same time, then the protein will be found inside the micrsome Protein Synthesis and Transport Samuel Tobias missing the signal sequence, therefore a mature protein RER: What are the major players? i) amino terminal signal sequence of newly initiated polypeptide (nascent proteins) ii) Signal­Recognition Particle (SRP) iii) SRP receptor embedded in ER membrane iv) translocon: protein channel v) cleavage site where signal sequence is cut by a signal peptidase Contranslational Translocation Done in a cell­free (in vitro protein translation) system The mRNA codes for a protein that is secreted It is recognized by ribosome in the cytosol, and starts to get translated However, at the amino terminus, there is a unique sequence of amino acids that shows that it is destined for  secretion A protein can recognize the sequence, and binds to it, and the ribosome Protein Synthesis and Transport Samuel Tobias The whole complex will move towards the SRP receptor GTP binds to SRP receptor, gives it a higher affinity for the complex Once it makes it to the receptor, the receptor is in close proximity to the translocon. A pore. When the complex gets to the receptor, it triggers the translocon to relax a bit, and the pore opens up The protein can then be imported as it is translated,  A membrane associated peptidase will recognize the signal sequence, and cuts it off, the protein is still  translated into the ER When it is completed, it dissociates from the receptor, and the protein is now inside the ER Protein Modifications in the ER Specific proteolytic cleavage Gycosylation Formation of disulphide bonds Formation of polypeptide chains Protein Synthesis and Transport Samuel Tobias Glycosylation most secreted proteins are glycosylated N­Acetylglucosamine, mannose, glucose branched sugars, not monosaccharides Enzymatic transfer  of 14­residue oligosaccharide  precursor from dolichol carrier (a glycolipid) to an  ASPARAGINE (Asn) residue of a nascent polypeptide by oligosaccharyl transferase. Several glycosidases work to subsequently modify N­glycan. Glycosylation functions: protein folding, confer protein stability, cell adhesion, etc.  Proteins with attached carbohydrates are known as glycoproteins. N­linked oligosacharides: carbohydrate chain is attached to the amide nitrogen of ASPARAGINE. Oligosaccharyltransferase will recognize sequence of certain apragine residues of nascent polypeptide  stick big complex branched sugar onto it certain glycosidases selectively chew off a few of the sugars from the branch.  some of the glycosylation confers charges to the protein, and insures the protein folds properly also stability, and if it gets to cell membrane, 
More Less

Related notes for Biology 2382B

Log In


Don't have an account?

Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.