Study Guides (238,467)
United States (119,812)
Biology (282)
All (6)

Complete Intensive Cell Biology Notes Part 1 (4.0ed the final exam)

12 Pages
Unlock Document

Boston University
CAS BI 213

BI213 RNA Synthesis and Processing Transcription (Tranx) in Prokaryotes RNA Polymerase and Tranx • Central Dogma = DNA –transcription­­> RNA –translation­­> Protein • All cells inherit same genes, so regulation of expression is what makes one cell  different from another • E. coli RNA polymerase: synthesizes RNA in 5’ to 3’ direction, like DNA pol.;  has 6 subunits (Figure 7.1) o Bottom unit s = promoter recognizer; detachable from 5 core polymerase  units; specialized to different conditions (e.g. starvation vs. nutrient  availability) o Core pol. unit is RNA elongator o RNA pol. does not need a primer like DNA pol. Can synthesize RNA de  novo at the beginning of a gene\ s subunit required for correct  identification of transcription initiation sites \ can bind to DNA template  and just begin replication (Figure 7.3) • Promoter: pol. binds to this sequence to start tranx of genes downstream o In prokaryotes, two sets of sequences at ­10 and ­35 (position relative to  tranx initiation site at +1) are similar in many genes (Figure 7.2)  GC and TATA box  s subunit scans for this then rest of the polymerase comes; don’t  know how pol. is signaled to join s but could be a conformation  change that allows rest to bind to s subunit  These ­10 and ­35 promoter elements (called consensus sequences)  are very important for efficient transcription o Sequence of events in tranx by E. coli RNA pol. (Figure 7.3) 1. Core + s subunit pol. binds nonspecifically to DNA template 2. Migrates along molecule upstream (toward 3’ end) until s subunit  on bottom binds specifically to ­10 and ­35 promoter elements \  forms closed­promoter complex 3. Unwinds DNA to form open­promoter complex 4. Tranx begins 5. s subunit is released, leaving core pol. to continue transcribing 6. Core pol. moves along DNA, elongates new RNA until termination o Termination of tranx: 2 ways  Rho factor independent: GC­rich sequence forms stem loop that is  too heavy for DNA to bind to \ RNA falls off (Figure 7.5)  Rho factor dependent: helicase­like protein binds to ssRNA and  “unwinds” it from DNA template Repressors/Negative Control of Tranx • Prok. tranx mostly regulated at initiation, but also at elongation • Ex] only need to make b­galactosidase, the enzyme that breaks lactose down in  galactose and glucose, in presence of lactose o Mechanism shown in Figure 7.7: negative control of lac operon  Operon = promoter + operator + structural genes  Operator (o) is next to tranx initiation site  i  = away from operon; encodes repressor protein that blocks tranx  when bound to o  Lactose not present, repressor binds to operon, tranx is blocked, b­ galactosidase not produced  Lactose present, lactose binds to repressor, repressor can’t bind to  operon, tranx not blocked, b­galactosidase produced o Cis­acting control elements: regulatory sequences (e.g. operator) that  affect only expression of linked genes on same DNA Positive Control of Tranx • Ex] Glucose is preferred energy\ low glucose levels activate lac operon o Mechanism shown in Figure 7.8: positive control of lac operon  Lower glucose levels = higher cAMP levels  cAMP binds to CAP, a tranx regulatory protein  cAMP + CAP bind to target DNA, sequences upstream of tranx  start site on lac operon  CAP interacts with a subunit of RNA pol. and helps it bind to the  promoter to start tranx Eukaryotic RNA Polymerases and General Tranx Factors • Tranx more complex in euk.s than in prok.s because... 1. 3 euk. nuclear RNA pol.s that transcribe distinct classes of genes 2. Euk. pol.s need to interact w/ many extra proteins to specifically  initiate/regulate tranx 3. Tranx takes place on chromatin \ regulation of chromatin structure is  important factor in tranx regulation Eukaryotic RNA Polymerases • Table 7.1 shows 3 nuclear RNA pol.s that transcribe different classes of genes o All 3 pol.s are complex enzymes and have 12­17 subunits o Share common features with each other and with bacterial RNA pol.  Euk. RNA pol.s all have 9 conserved subunits, 5 of which are  related to core subunits of bacterial RNA pol. General Tranx Factors (TFs) and Initiation of Tranx by RNA Pol. II • RNA pol. II synthesizes mRNA; can only start tranx w/ help of extra proteins • Discovery of General TFs: transcribe (tranx’b) most pol. II promoters \ part of  basic tranx machinery; TFs encoded from ~10% of genes \ important o TATA Box: ~25­30 bases upstream of start site, resembles ­10 sequence in  bacterial promoters, present in ~10­20% of RNA pol. II promoters o Other sequences in promoters function differently when combined in  different combos to bind GenTFs • Five TFs minimally required to start tranx by pol. II (Figure 7.10) o TATA + TFIIB recog. site (BRE) + initiator (Inr) elements + other  promoter elements (DCE, MTE, DPE) = pol. II promoter o TFIID binds: TATA­binding protein (TBP) binds to TATA box, TBP­ associated factors (TAFs) bind to Inr and downstream elements, all  subunits part of TFIID complex o TFIIB binds to TBP and BRE o Polymerase and TFIIF (which includes helicases and CTD kinase) then  bind \ promoter elements are recognized by TFIID and TFIIB, not by pol.  II o TFIIE and TFIIH associate with complex o CTD is C­terminal domain of largest subunit of RNA pol. • Mediator: 20+ subunit protein complex that links GenTFs and RNA pol. at  promoter (Figure 7.11); aids in basal tranx and links GenTFs to Specific TFs to  aid in tranx regulation o Binds to GenTFs and RNA pol. o Associates with nonphosphorylated (non­P’ed) CTD of pol. II o CTD is phosphorylated (P’ed)  o Tranx begins o P’ed CTD binds elongation and processing factors that aid mRNA  synthesis o Mediator releases pol. II + P’ed CTD complex Tranx by RNA Pol. I and II • Euk. pol.s that tranx rRNA, tRNA, and small noncoding RNA encoding genes  require specific TFs to associate with those promoters • RNA pol. I: only tranx’bes rRNA genes that are in tandem repeats o Yields large 45S pre­rRNA, then processed to yield 28S, 18S, and 5.8S  rRNAs (Figure 7.12) o rRNA gene promoters span ~150 bases upstream of start; recognized by  upstream binding factor (UBF) and selectivity factor 1 (SF1) (Figure 7.13)  UBF and SF1 bind together to rRNA promoter  Recruit pol. I to form initiation complex • Pol. III: tranx’bes 5S rRNA, tRNA, small RNAs that splice/transport proteins o See Figure 7.14 for details; important take­home is that “these genes are  tranx’d from 3 distinct classes of promoters, 2 of which lie within, rather  than upstream of, the tranx’d sequence” \ pol. is first in initiation complex,  with TFs bound upstream of it Regulation of Tranx in Eukaryotes • More complex than in prok.s, but some basic principles are conserved • Controlled by proteins that bind to gene­specific TFs • Difference in packaging; euk. DNA in chromatin \ tranx availability limited • \ chromatin structure modifications (mod.s) important to tranx control • Noncoding RNAs, along with proteins, modify chromatin structure \ regulate  tranx Cis­Acting Regulatory Sequences: Promoters and Enhancers • Ex] lac operator in bacteria is a cis­acting sequence; controls tranx of genes next  to it • Identified in mammals with gene transfer assays to study suspected regulatory  regions of cloned genes (Figure 7.15) o Active regulatory sequence causes tranx of reporter gene (e.g. firefly  luciferase = bioluminescent enzyme) to see if that sequence directs tranx o In vitro mutagenesis then used to determine roles of certain sequences in  that region • Cis­acting reg. sequences often located upstream of tranx start site (Figure 7.16):  shows CCAAT, GC, and TATA boxes upstream of a herpes virus promoter • Enhancers: regulatory sequences located sometimes more than 50 kb away from  tranx start site, even located on a different chromosome (called transvection);  stimulates higher rate of tranx o Can be upstream or downstream of promoter; oriented forward or  backward (Figure 7.18) o Bind gene­specific TFs; responsible for control of gene expression o Can act from far away because of DNA looping (Figure 7.19)  DNA forms loop stabilized by the protein cohesin  Enhancer TFs can \ interact with Mediator/GenTFs at promoter  \ No real difference between enhancers (far from start site) and cis­ acting regulatory sequences (next to start site) o Usually have multiple functional sequence elements that bind different  TFs \ proteins cooperate to regulate expression  Combo of individual elements = tissue­specific expression o Insulators/Barrier Elements: divide chromosomes into domains \ make  enhancers specific to their promoters (Figure 7.21); serve as binding sites  for CTCF protein, which blocks enhancer activity and works with cohesin  to loop DNA TF Binding Sites • Identifying promoter or enhancer TF binding sites: methods = ... o Electrophoretic­Mobility Shift Assay (EMSA) (Figure 7.22):  Radiolabeled DNA fragments divided; one half is incubated w/ a  DNA sequence­specific protein  Samples analyzed by electrophoresis in nondenaturing gel \  protein­DNA complex intact  Protein binding detected by slower migrating  Sequence detected by comparing complexed and free DNA o Chromatin Immunoprecipitation (Figure 7.24):  Cells treated w/ formaldehyde to cross­link DNA and proteins  Sonicated to make chromatin fragments  Fragments incubated w/ antibody against TF of interest  Chromatin­antibody complex collected (Figure 4.29)  Cross­links reversed to separate DNA and TFs  DNA purified to get fragments w/ binding sites for TF of interest  Immunoprecipitated fragments analyzed by 1) PCR for individual  binding site or 2) genome­wide analysis of binding sites by  microarrays or high­throughput sequencing to identify all binding  sites for the TF within the genome Transcriptional (Tranx’al) Regulatory Proteins • Tranx’al regulatory proteins isolated based on binding to specific DNA sequences o DNA­Affinity Chromatography (Figure 7.25, ex] is Sp1):  Double stranded (ds) oligonucleotide w/ repeated GC box  sequences is bound to agarose beads  Beads and GC box DNA poured into column  Mix of cell proteins, including Sp1, is added to column  Because Sp1 specifically binds to GC box, it stays in column  Other proteins flow through, isolating Sp1 in column  High salt buffer added to column to dissociate Sp1 from GC box  DNA \ yielding purified Sp1 o “Genes encoding other TFs have been  isolated by screening cDNA  expression libraries to identify  recombinant proteins that bind to  specific DNA sequences.” (Cooper, pg  260) • DNase I Footprinting/Protection Assay (from  PowerPoint only):  Restriction fragment containing  a specific binding site is  labeled at 1 end  Half of sample is incubated w/ a specific DNA­binding protein  DNase I makes single­strand breaks (nicks) in the DNA  A small amount of enzyme is used so that there is an average of <1  nick/strand  Denaturing gel unbinds protein from DNA  Footprint shows where protein bound on fragment \ specific  sequence that bound that protein can be analyzed when compared  to non­protein bound sample Structure and Function of Tranx’al Activators • Tranx’al Activators: proteins that bind to regulatory DNA sequences and stimulate  tranx o About 2500 human genes encode transcriptional regulatory proteins o Dogma: gene regulation in mammalian cells controlled by activators o 2 domains: the DNA­binding domain binds to DNA to anchor it to the  proper site, and the activation domain interacts w/ Mediator or other  tranx’al machinery to stimulate tranx (Figure 7.26) o Distinct DNA­binding domains (Figure 7.27):  Zinc fingers: loops in which alpha­helix and beta­sheet  coordinately bind a zinc ion  Helix­turn­helix: 3 (maybe 4) helical regions, one helix (#3) makes  most of the contact with DNA and #1 and #2 lie on top of it and  stabilize that contact  Leucine zipper: two leucines bind by hydrophobic interactions of  their side chains and dimerize around the DNA helix, h
More Less

Related notes for CAS BI 213

Log In


Don't have an account?

Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.