DNA Synthesis and some genetics.docx

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Derek Mc Lachlin

Nucleic Acids and DNA Packaging 10/02/2013 Frederick Griffith (1928) There is a molecule in bacteria that gives them the ability to become pathogenic This molecule can be transferred between bacteria in a process called transformation Avery, MacLeod, McCarty, 1944 Showed the transforming molecule is DNA Hershey and Chase, 1952 The hereditary material in a bacterial virus is also DNA. Franklin, Crick, Watson, and Wilkins (1953) Proposed a structural model for double­stranded DNA Used X­ray crystallography to deduce the structure of DNA Look at diffraction pattern Watson and Crick found structure, but Franklin and Wilkins used x­ray crystallography DNA Double Helix (B­form DNA) Sugar­phosphate backbone faces outwards Nitrogenous bases face inwards Right­handed helix Wide major groove, narrow minor groove What types of interactions promote the stability of the secondary structure of DNA? Hydrogen Bonding and hydrophobic interactions Base stacking and hydrophobic interactions Base­pairs are not oriented in the middle, they are slightly off to the side. Nucleic Acids are made of nucleotide building blocks Sugars Nitrogenous bases Phosphate group A nucleoside refers to the sugar and the nitrogenous base, excluding the phosphate group RNA has a hydroxyl group on the 2 prime Carbon DNA has a hydrogen on the 2 prime Carbon A single nucleic acid strand has polarity 5’ end to 3’ end Hydrogen bonding occurs between the bases A purine pairs with a pyrimidine GC is more stable that AT which is more stable than AU The structure of DNA provides a physical basis for Chargaff’s Rules Ratio of Adenine to Thymine is approx. 1 Ratio of Guanine to Cytosine is approx. 1 Ratio of Purines to Pyrimidines is approx. 1 A+G/C+T=1 RNA differing from DNA Ribose sugar (not as stable) 2’ carbon has an OH Uracil instead of thymine RNA doesn’t normally form a double­helical structure, but it can have significant secondary structure Stem­loop structure tRNA double helix stem single stranded loop Tetrahymena ribozyme Carries out enzymatic reactions Composed of some double helix and other single strands all bunched together You have isolated nucleic acids from a new type of mammalian virus.  It is composed of 25% U, 25%A,  20%G, and 30%C.  The genome of this virus must be composed of: Single­stranded  RNA C doesn’t = G Nucleic acid polymerization In the cell, nucleotides exist as nucleoside triphosphates Very high energy The energy stored within high­energy phosphate bonds in the deoxynucleoside triphosphates is used to  drive DNA polymerization In DNA, phosphates interact with the 3’ OH group and the breaking of one of those bonds drives the  reaction forward. Nucleosomes=DNA + histones Chromatin=nucleosomes + other associated proteins DNA wraps around histone proteins (only in eukaryotes) to form greater structures Beads on a string…each bead is a nucleosome Nucleosomes can be further packaged into more compact structure The most compact form of DNA is found in mitosis Steps of Packaging Chromosome Protein scaffold 30­nm fiber nucleosome with 8 histone proteins Histones are basic (positive charge) The negatively charged DNA will associate tightly with the histone protein Compared to open chromatin, condensed chromatin is less accessible to enzymes and other proteins Treating DNA with DNase I will lead to the cutting of the phosphodiester bonds One way to promote chromatin opening: acetylation of histones Histone acetyltransferase (HAT) will carry out this reaction Removes + charge from histones DNA isn’t associated as tightly Promote decondensation of chromatin Some human diseases are caused by defects in chromatin modifying enzymes. Rubinstein­Taybi Syndrome (RTS) RTS is causedby mutations in genes names CBP or p300 Both of these genes code for HATs DNA Synthesis Additional practice problems and answers are on trunk in the Resources folder Different types of cells have vastly different cell cycle length MPF= cyclin + cyclin­dependent kinase (cdk) Two phosphate groups are added to the cdk during G2 One promotes kinase activity One inhibits kinase activity When the inhibitory phosphate is removed, MPF becomes active Checkpoints in Mitosis G2 checkpoint Pass checkpoint if: chromosomes have replicated successfully DNA is undamaged Activated MPF is present M­phase checkpoints (2) Pass checkpoints if: Chromosomes have attached to spindle apparatus Chromosomes have properly segregated and MPF is absent G1 checkpoint DNA Synthesis Pass checkpoint if: Cell size is adequate Nutrients are sufficient DNA is undamaged Social signals are present A G1 checkpoint ensures that cells are ready to begin DNA synthesis 1. Growth factors arrive from other cells, or the cell itself 2. Growth factors cause increase in amount of cyclin and E2F 3. Cyclin binds to cdk and cdk is phosphorylated.  Rb inactivates E2F by binding to it. 4. Inactivating phosphate is removed from cdk and active cdk phosphorylates Rb 5. Phosphorylated Rb releases E2F 6. E2F triggers production of S­phase proteins Fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI): a direct way to visualize the cell cycle Utilizes knowledge that levels of regulatory proteins in the cell cycle rise and fall during cell division One protein fused to red fluorescent protein, another protein fused to green fluorescent protein Steps in bacterial cell division Chromosome is located mid cell Chromosome replicates Chromosomes pull apart; ring of FtsZ protein forms DNA Synthesis FtsZ ring constricts.  Membrane and cell wall infold Fission complete Meselson­Stahl Experiment They separated parental and newly­synthesized DNA on the basis of it density Old strands contained N15 New strands contained N14 The difference in density allowed different generations to be separated by density. 3 Models for how DNA might be copied Semi­conservative The strands separate and each gives rise to a new complementary strand Conservative Double­stranded DNA gives rise to a new double­stranded structure Dispersive Double­stranded DNA replicates over short stretches in no particular order Meselson­Stahl Results After generation 1 DNA all of intermediate density After generation 2 ½ DNA of low density ½ DNA of intermediate density DNA Synthesis This result was only consistent with semi­conservative replication, in which each  parental strand is used to synthesize a complementary strand DNA Polymerase is the enzyme that catalyzes this reaction Deoxynucleoside triphosphates are added to a template Always 5’ ­> 3’ The replication bubble: DNA synthesis starts at an origin and proceeds in both directions DNA is always synthesized in 5’ to 3’ Leading strand and Lagging strand both go 5’ to 3’ they move in opposite directions The lagging strand is copied discontinuously Okazaki Fragments The fragments from the lagging strand DNA Replication and Repair 10/02/2013 wBi­directional DNA synthesis requires many enzymes Leading strand synthesis (continuous): Helicase Opens up double helix Single­strand DNA­binding proteins (SSBP) Stabilizes single strands Primase Synthesizes RNA primer DNA polymerase III (involved in majority of DNA replication) works in 5’ ­> 3’ direction, synthesizing leading strand Sliding clamp Holds DNA polymerase onto the template Topoisomerase Relieves the twisting forces Breaks a single phosphodiester bond and helps unwind extra tension at the replication fork Lagging strand synthesis (discontinuous): Primase Synthesizes RNA primer DNA polymerase III Synthesizes okazaki fragments DNA Replication and Repair 10/02/2013 DNA polymerase I Removes RNA and replaces it with DNA DNA ligase Closes the gap between the okazaki fragments Replisome is the entire complex of replicating DNA ***A loop forms in the lagging strand template so that the two DNA polymerases are moving towards the  replication fork While eukaryotic DNA replication uses different proteins, we only need to know the names of the  prokaryotic proteins What happens when the replication fork reaches the end of a linear chromosome? (eukaryotic only) Helicase unwinds the end of the DNA helix at the end of the chromosome DNA polymerase comple
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