Class Notes (836,580)
United States (324,591)
Biology (619)
BIOL 2324 (9)
Lecture

lab restric enz.doc

12 Pages
73 Views
Unlock Document

Department
Biology
Course
BIOL 2324
Professor
Thomas Manning
Semester
Fall

Description
Melissa Johnson Lab: Monday 2:50 TA: Manasa Madasu October 11, 2010 Restriction Enzyme Digest Analysis Introduction Restriction enzyme digest is the procedure by which it is possible to cleave the sugar­phosphate  backbone of a sample of DNA in a specific place using endonucleases.  Endonucleases are enzymes  isolated from bacteria that identify a specific sequence of base pairs in DNA and cut the backbone of  1, 2,3 DNA at that sequence every time it is encountered.   Restriction enzyme digest is a valuable means of  studying DNA and finding specific locations of particular DNA sequences.  It is also essential in the  5 biotechnology industry and the study of genetics.   Some restriction endonucleases cleave straight across  the DNA and others do not.  These restriction enzymes that do not cut straight across the backbone leave  4, 5 base pairs exposed at the restriction site.  These are called “sticky ends” on the DNA sequence.   When  the cleaved fragments of DNA are then mixed back together or mixed with other DNA fragments with  complementary base pairs, they can be recombined with new sequences.  This recombinant DNA  technology is useful in the study of genetics in order to see the effects of particular genes.   The three  restriction endonucleases used throughout this experiment are HindIII, PVUII and BglI.  HindII is a  restriction enzyme isolated from Haemophilus influenzae that cuts at the following recognition site 1, 2: 6 5’… A*AGCTT …3’ 3’… TTCGA*A …5’ PvuII is a restriction enzyme isolated from Proteus Vulgarus that cuts at the following recognition  2, 7 sequence : 5’… CAG*CTG …3’ 3’… GTC*GAC …5’ BglI is a restriction enzyme isolated from Bacillus globigii that can have several different restriction  2, 8 sites due to its recognition sequence : 5’… GCCNNNNGCC …3’ 3’… CGGNNNNCGG …5’ These restriction enzymes will act on plasmid DNA, cutting at their specific sequences and breaking the  plasmid DNA into fragments.  Plasmid DNA is circular DNA that can be used as a vector by inserting  1, 2, 5, 6 specific DNA sequences and transferring the DNA to a host cell.   This is the basis for a great deal  of biochemical research.  Once the endonucleases cleave the DNA into fragments, the fragments can be  run through gel electrophoresis.  Gel electrophoresis separates molecules based on size and charge.  The  1, 2 further the distance the fragments travel, the smaller they are.   The distances traveled by the fragments  will be compared to a set ladder DNA fragments whose numbers of base pairs are known.  In doing this,  the number of base pairs of each of the fragments can be determined.  Once the relative size of the  fragments is determined, a map of the plasmid DNA can be generated illustrating the site of each  endonuclease cleavage in relation to the others.   Restriction mapping is an extremely useful tool as it  allows researchers to determine plasmid DNA sequences which is necessary in the manipulation of the  plasmid DNA.   1, 2 Materials and Methods • Plasmid DNA • PvuII restriction enzyme • Buffer (50mM NaCl, 10mM Tris­Cl,  • BglI restriction enzyme 10mM MgCl2, 1mM dithiothreitol,  • 0.1% agarose gel ph7.5) • gel­red • Distilled water • micropipettors • HindIII restriction enzyme • ependorf tubes Several digest samples were prepared using the plasmid DNA, distilled water, buffer and the  restriction enzyme.  First, a control was prepared using 2μl buffer, 2μl plasmid DNA, and 16μl distilled  water.  Three single digests were prepared using 2μl of each of the enzymes and 2μl buffer, 2μl plasmid  DNA and 14μl distilled water.  Three double digests were prepared using 2μl each of 2 different  enzymes, 2μl plasmid DNA, 2μl buffer, and 12μl distilled water.  The first double digest contained  HindIII and BglI.  The  second contained PvuII and  BglI.  The final double  digest contained HindIII  and PvuII.  After these  samples were prepared they  were incubated for one  hour at 37 degrees Celsius.   A sample of 10μl was taken  from each digest and 2μl of  tracking buffer was added  to it in order to make the  sample more dense than the running buffer for use on the gel.  The samples were added to the gels and  then gel electrophoresis was carried out on a 0.1% agarose gel.  After the samples were given time to  run on the gel, they were submerged in gel­red to dye the samples in order to make them visible under  UV light.  Each gel was observed under UV light and a photo was taken of the most clear and accurate  gel.2 Results 1. Ladder 2. Undigested (control) 3. Hind III 4. PVU II 5. Bgl I 6. Hind II + Bgl I 7. PVU II + Bgl I 8. Hind III + PVU II  50 bp Invisible band Figure 1. Restriction digest using gel electrophoresis.  Table 1. DNA ladder distances traveled vs. number of base pairs. Distance (cm) #Base Pairs 3.20 12000 4.60 5000 6.40 2000 6.90 1650 7.80 1000 8.10 850 8.50 650 8.90 500 9.40 400 10.0 300 10.3 200 10.6 100 Figure 2. Standard Curve of ladder DNA.  Table 2. Plasmid fragment distances and estimated sizes Distance fragment  Distance  Distance  Distance    1/un fragment 2 fragment 3 fragment 4 Total Size (bp) 3. Hind III 5.60cm X X X X Number BP 3222       3222  4. PVU II 6.20cm 9.50cm X X X Number BP 2269  330     2599 5. Bgl I 6.80cm 7.40cm X X X Number BP 1598 1125     2723  6. Hind +Bgl 7.0cm 7.40cm 9.80cm X X Number BP 1422 1125 277   2824  7. PVU+Bgl 7.50cm 8.0cm 9.40cm Approx. 12cm X 50 (invisible  Number BP 1061 793 350 band) 2254 8. Hind + PVU 5.90cm 9.80cm 9.80vm X X Number BP 2704 277 277   3258  Calculations: Ladder y=mx+b and y=log bp From standard curve; y=­0.2538x+4.9294 x= 5.6 y= ­0.2538(5.6) + 4.294 y=3.5081  Antilog y=3222=#bp x= 5.8 y= ­0.2538(5.8) + 4.294 y=3.4574  Antilog y=2867=#bp x= 5.9 y= ­0.2538(5.9) + 4.294 y=3.432  Antilog y=2704=#bp x= 6.2 y= ­0.2538(6.2) + 4.294 y=3.3558  Antilog y=2269=#bp x= 6.8 y= ­0.2538(6.8) + 4.294 y=3.2036  Antilog y=1598=#bp x= 7.0 y= ­0.2538(7.0) + 4.294 y=3.1528  Antilog y=1422=#bp x= 7.4 y= ­0.2538(7.4) + 4.294 y=3.0513  Antilog y=1125=#bp x= 7.5 y= ­0.2538(7.5) + 4.294 y=3.0259  Antilog y=1061=#bp x= 8.0 y= ­0.2538(8.0) + 4.294 y=2.899  Antilog y=793=#bp x= 9.4 y= ­0.2538(9.4) + 4.294 y=2.5437  Antilog y=350=#bp x= 9.5 y= ­0.2538(9.5) + 4.294 y=2.5183  Antilog y=330=#bp x= 9.8 y= ­0.2538(9.8) + 4.294 y=2.4422
More Less

Related notes for BIOL 2324

Log In


OR

Join OneClass

Access over 10 million pages of study
documents for 1.3 million courses.

Sign up

Join to view


OR

By registering, I agree to the Terms and Privacy Policies
Already have an account?
Just a few more details

So we can recommend you notes for your school.

Reset Password

Please enter below the email address you registered with and we will send you a link to reset your password.

Add your courses

Get notes from the top students in your class.


Submit