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Western University
Biology 2382B
Robert Cumming

Lecture 2: Imaging in Cell Biology Vinny Aggarwal Types of Microscopy Bright­field microscopy Phase­contrast microscopy Differential interference contrast microscopy Fluorescence microscopy GFP and Fluorescent Fusion protein Confocal microscopy Deconvolution FRET Electron microscopy The First Microscope Anton van Leeuwenhoek was the first person to observe living protozoa and bacteria Coined the term “animalcules” Used simple, single lens microscopes Went on to visualize human red blood cells and sperm With great skill at grinding lenses, naturally acute eyesight, and lots of patience, he was able to achieve a  magnification of ~200X Two important functions of microscopes Magnification Resolution Bright­field Microscopy Controlled light source Condenser lens to focus light on the specimen Objective lens to collect light after it has passed through the specimen magnification of ~100X Ocular or eyepiece lens to focus image on the eye magnification of ~10X Overall magnification of a typical light microscope is 40X to 1000X Visible detail is due to the differences between white and black, caused by different levels of light refraction  between cellular components Unimpeded light appears white, refracted light appears darker Only structures with a high refractive index (ability to bend light) are observable  Resolution The ability to distinguish between two very closely positioned objects as separate entities A conventional microscope can never resolve objects that are less that 0.2 um (200 nm) apart Smaller resolution is better A light microscope can only discern details up to plant/animal cells and bacterium, beyond that an electron  microscope is required Distance resolved between 2 points: D = (0.61 × λ)/( N × sin α) λ = wavelength of light N × sin α = numerical aperture (higher is better) N = refractive index of medium between the specimen and objective lens α = ½ angle of light entering objective lens To achieve optimal resolution Decrease the wavelength of light Increase refractive index of the medium (e.g. use oil instead of air) Use an objective lens with a wider α angle Light microscopy uses wavelengths in the UV­vis region (300­700 nm) whereas electron microscopy uses  much shorter wavelengths (1 nm) Electron microscopy can also take advantage of the wave­like properties of light Obtaining Contrast in Light Microscopy by Exploiting Changes in the Phase of  Light Refraction is the ability to bend or change light Certain parts of the cell refract light more than other parts When refracted light is recombined at the eye, the waves will be out of sync (in comparison to un­refracted  light) As a result, there will be some cancelation of light, making the light appear dim Differentiating between dim and bright areas helps to increase resolution; to increase resolution we must  increase interference Maximum interference would be ½λ since it would be maximally out­of­sync with unimpeded light Cellular constituents with high refractive properties can slow the passage of light by a quarter wavelength  (~¼λ)  Phase­Contrast Microscopy Used to examine live ‘unstained’ cells Small differences in refractive index and thickness within the cell are further exploited and converted into  contrast visible to the eye Is essentially a regular light microscope with 2 added components Annular diaphragm  restricts light source into a hollow cone of light that hits the specimen After the light is passed through the specimen, it will be refracted ~¼λ and pass through the objective light  where it then hits the phase plate The ~¼λ refracted light gets refracted another ~¼λ The light that was unimpeded is able to pass through the phase plate without being refracted Sometimes, a phase halo is created around the outside of specimen due to the addition of wavelengths  (rather than cancelling them out) Areas on the edge of the cell are sometimes more in­sync than out­of­sync, so they amplify instead of  cancelling each other out Differential Interference Contrast (Nomarksi) Microscopy Used to examine live ‘unstained’ cells Small differences in refractive index and thickness are converted into contrast visible to the eye DIC microscopes are equipped with polarizers Sends polarized light (only some planes of the wavelength are permitted) through the specimen and  recombines them after they pass through the specimen for interference to create an image based on  contrast Defines the outline of large organelles such as the nucleus and vacuoles and provides a better detail of cell  edge Fluorescence Microscopy Doesn’t use white light but rather light of only specific wavelengths Uses a property of certain molecules to fluoresce (emit visible light) when they absorb light at a specific  wavelength Dyes or ‘fluorophores’ absorb energy of a certain wavelength and emit energy at a different, higher  wavelength which is detected as visible light Different fluorophores have different optimal wavelengths, which correlates to the amount of energy it takes  for them to absorb and emit visible light Difference between the optimal absorption and optimal emission wavelength is called the stokes shift You want a large stoke shift, so that the emitted light you are detecting is very different from the light you  use to excite Location of fluorescent dyes or fluorescent proteins can be imaged Can visualize more than one protein or cell structure by staining different structures with dyes that fluoresce  different colors Needs to be done one at a time and then the separate images overlaid to create a full composite image of  multiple structures Uses a very powerful light source, which includes the UV range below 400 nm Excitation filter allows only the specific wavelength of light that corresponds to the optimal wavelength for  absorption by the dye A dichoric mirror allows some wavelengths of light through while reflecting others The dichoric mirror first reflects the light passed through the excitation filter down through the objective light  and onto the specimen The dye on the specimen absorbs this light, and fluoresces back light at a different wavelength This emitted light is goes back through the objective lens and is allowed to pass through the dichoric mirror The emitted light is again magnified through a projection lens Before being displayed on the image plane, the light passes through an emission filter to ensure only light  of the emission wavelength is displayed Fluorescent dyes are available to stain specific cell structures and organelles DAPI or Hoescht is used to stain nuclei blue Mitotracker Red stains mitochondria red Tubulin is often stained with a green dye A dye can be conjugated with antibodies to localize any molecules of interest in cells; this is called  immunofluorescent staining Monoclonal antibody techniques allows the detection of specific proteins within cells Inject a mouse with the protein of interest The mouse will begin develop some B­cells that produce antibodies to detect an antigen X on the protein These B­cells proliferate as nodules in the spleen of the mouse Although you could harvest these B­cells to produce your antibody, they are primary cells and will  eventually die; we need to make them immortal Mix and fuse these B­cells with mutant mouse myeloma (cancerous) cells Grow new cell culture on HAT medium Normal mouse cells grow on HAT medium, myeloma cells do not Untransformed myeloma cells will not grow on HAT medium, untransformed B­cells will grow for a short  period but eventually die, but hybrid cells will grow on the HAT medium indefinitely Culture individual hybridoma colonies in separate wells and test each well for the presence of antibody  specific for the antigen X Not all the hybridoma cells will produce the antibody (some may have been derived from B­cells that did not  develop the desired antibody) Some proteins have different antigens, but we went to produce antibodies for only a single antigen Immunofluorescence Microscopy Antibodies are prepared for specific proteins (e.g. tubulin,
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